病理検体における微量RNA組織局在検出法の低コピー数ウイルス検出への応用

目的感染細胞中のウイルスコピー数が非常に少ない腫瘍関連ウイルスについて、先端的RNA検出法により病理標本上での組織局在の検出を行い、その有用性や再現性の高い安定した方法の確立について検討する。方法ヒトヘルペスウイルス8型(HHV8)の関与が報告されている原発性滲出性リンパ腫(PEL)、カポジ肉腫、多巣性キャッスルマン病と診断されたホルマリン固定パラフィン包埋検体(以下パラフィン検体)および凍結検体の切片を用い、下記の検討を行った。(1)DNAを抽出後、PCR法によるHHV8存在のスクリーニング(2)Tyramideを利用した高感度in situ hybridization(ISH)法(3)in situ RT-LAMP法を用いた検出系の構築(4)(2)(3)の結果を比較し、検出感度や特異性、再現性手技上の問題点について検討し、実際の病理検査への応用の可能性について探る研究成果PCR法によりHHV8の存在が確認されたPELとカポジ肉腫の検体について、(2)(3)の検討を行った。両手法でproteinaseK濃度や反応時間、反応温度など様々な検出条件の検討を行った。その結果、(2)(3)ともにPELの凍結切片での検出は可能であった。しかし、同検体のパラフィン切片およびカポジ肉腫検体では検出ができなかった。カポジ肉腫ではPELと比較し感染コピー数が非常に少ないとされており、またパラフィン検体では凍結検体に比べ少なからず核酸の保存状態が低下するため、より高感度な検出が可能となる条件をさらに模索する必要がある。一方で凍結切片での検出可能例があったことから、検出系としては利用可能であると考えられた。特にin situ RT-LAMP法は必要機材や手技が比較的簡便であり、更なる条件検討を重ねることで実際の病理検査においてもその応用が期待されると考えられた。

目的感染細胞中のウイルスコピー数が非常に少ない腫瘍関連ウイルスについて、先端的RNA検出法により病理標本上での組織局在の検出を行い、その有用性や再現性の高い安定した方法の確立について検討する。方法ヒトヘルペスウイルス8型(HHV8)の関与が報告されている原発性滲出性リンパ腫(PEL)、カポジ肉腫、多巣性キャッスルマン病と診断されたホルマリン固定パラフィン包埋検体(以下パラフィン検体)および凍結検体の切片を用い、下記の検討を行った。(1)DNAを抽出後、PCR法によるHHV8存在のスクリーニング(2)Tyramideを利用した高感度in situ hybridization(ISH)法(3)in situ RT-LAMP法を用いた検出系の構築(4)(2)(3)の結果を比較し、検出感度や特異性、再現性手技上の問題点について検討し、実際の病理検査への応用の可能性について探る研究成果PCR法によりHHV8の存在が確認されたPELとカポジ肉腫の検体について、(2)(3)の検討を行った。両手法でproteinaseK濃度や反応時間、反応温度など様々な検出条件の検討を行った。その結果、(2)(3)ともにPELの凍結切片での検出は可能であった。しかし、同検体のパラフィン切片およびカポジ肉腫検体では検出ができなかった。カポジ肉腫ではPELと比較し感染コピー数が非常に少ないとされており、またパラフィン検体では凍結検体に比べ少なからず核酸の保存状態が低下するため、より高感度な検出が可能となる条件をさらに模索する必要がある。一方で凍結切片での検出可能例があったことから、検出系としては利用可能であると考えられた。特にin situ RT-LAMP法は必要機材や手技が比較的簡便であり、更なる条件検討を重ねることで実際の病理検査においてもその応用が期待されると考えられた。