GFP誘導体を利用した生細胞におけるイオンチャネル動態可視化法の確立

点击翻译按钮获取中文摘要

イオンチャネルに関しては質的調節(機能変化)が広く研究されてきたが、そればかりでなく量的調節(数の変化)も受ける。本研究は、近年注目されている量的変化を生細胞において観察する方法を確立する目的で行った。1.pH感受性蛍光蛋白質フルオリンをチャネルの細胞表面側に融合させたものを作製した。具体的には、PCR法により電位依存性カリウムチャネルKCNQ1の細胞外領域(1-2ループ)に、レシオメトリック・フルオリン(酸性化により488nm励起で515nmの蛍光が増加する)を挿入した(rpH-KCNQ1)。rpH-KCNQ1をHEK293細胞に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、rpH-KCNQ1が正常に細胞膜表面に移行していることが認められた。2.rpH-KCNQ1を発現させたHEK293細胞株に塩化アンモニウム10mMを投与し、酸性負荷を行ったところ、約40%の(細胞5個の平均値)蛍光強度の増加が観察された。融合したフルオリンは正常に機能しているものと思われた。3.これまでの生化学的検討でα1Aアドレナリン受容体(α1AAR)の活性化により、KCNQ1がエンドサイトーシスされることを観察していたため、α1AARとrpH-KCNQ1を共発現させたHEK細胞においてフェニレフリン1μMによる刺激を行い検討した。その結果、フェニレフリン投与後90秒で約15%(細胞10個の平均値)の蛍光量の増加が観察された。以上の結果から、原理的に今回の方法によってチャネルのエンドサイトーシスが測定可能であると考えられた。測定方法を確立させるには、ポジティブコントロール(β2アドレナリン受容体とフルオリンとの融合蛋白)との詳細な比較検討が必要である。また、電気生理学的な調節機構の確認も必要である。これらの検討に加え、蛍光測定装置での2波長の測定によるS/N比の向上を計り、方法を確立したい。