Korrelatives Kryo-Konfokalfluoreszenzmikroskop

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Beantragt wird ein aufrechtes konfokales Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop (LSM) mit einer Kryo-Einheit (cryo­stage) zur konfokalmikroskopischen Untersuchung vitrifizierter weicher, vorwiegend biologischer Materie bei minus 196°C und korrelierter Bildgebung und Strukturaufklärung derselben Proben mit Kryo-Transmissionselektronen­mikroskopie (Kryo-EM) und Kryo-Transmissionselektronentomographie (Kryo-ET). Die auf EM-Netzehen (grids) bereits vitrifizierten, in flüssigem Stickstoff befindlichen Proben sollen in die Kryo-Einheit eingeführt, bei 77K konfokal, mit maximaler Auflösung (hoher numerischer Apertur), Einzelmolekülfluoreszenzempfindlichkeit, guter spektraler Diskriminierung, vollständig (durch Montage aller Sichtbereiche), unter Erfassung der Netzehen-Topographie, aber auch in ausreichend Detail, nötigenfalls über Stunden mikroskopiert und zurück in den flüssigen Stickstoff verbracht werden, ohne dass Devitrifizierung oder Eiskontamination eintritt. Der Ablauf soll das Aufsuchen der interessanten Stellen (POi), das Wiederfinden der POi im Übersichtsbild im Kryo-EM (mit der Software SerialEM) mittels Korrelation von Merkmalen (landmarks) und Zuordnung der Koordinaten erlauben. Final soll eine Korrelationspräzision zwischen Fluoreszenz-und EM-Bild von 35 nm erreicht werden. Hauptanwendung ist die Aufklärung grundlegender Fragen des intrazellulären Transports am Beispiel des dynamischen COPII-Vesikelbildungsprozesses. Aufgeklärt werden sollen die Rolle der GTP-Hydrolyse, der Mechanismus der Vesikelabschnürung und die Auswirkungen von Cargo-Proteinen.