HDL中アポ蛋白の化学修飾解析と機能との関連について

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研究目的:タンパク質に対する化学修飾の一種である茄ホモシステイン化が、HDLの主要構成タンパクであるアポタンパクA1(以下、アポA1)の機能に及ぼす影響はこれまで分かっていない。それを推定するためには、ホモシステインが結合するアポA1分子上の位置を決定することが重要である。本研究では、その位置を決定するための技術を確立することを目指した。研究方法:チオプロピルセファロースビーズを使用したN-ホモシステイン化アポA1の特異的抽出法について等電点電気泳動を用いた分離法で評価した。さらにアポA1に結合したホモシステインを含むペプチドを、特異的に検出できるかどうかを質量分析法により検討した。研究成果:(1)N-ホモシステイン化アポA1の特異的抽出法の確立:N-ホモシステイン化によって導入されるスルフィド基をチオプロピルセファロースビーズにジスルフィド結合させることによって、マイクロチューブ内で茄ホモシステイン化アポA1を抽出・濃縮する方法を確立した。本法により、これまでできなかったN-ホモシステイン化アポA1の選択的な抽出に加え、小スケールかつ簡便に抽出操作ができるようになった。(2)オンレジンダイジェッション-質量分析法によるN-ホモシステイン化ペプチドの選択的検出:N-ホモシステイン化アポA1をチオプロピルセファロースビーズに結合したまま酵素消化し、ビーズに残ったペプチド成分を溶出させる。溶出したペプチドを質量分析計で検出することにより、ホモシステインが結合したペプチドだけを特異的に検出することができた。本法により、非特異的なペプチドも検出してきた従来法と比べて、アポA1上のN-ホモシステイン化位置を決定するための解析が飛躍的に簡便になった。