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タンパクとその遺伝子の発現を見る為のパラフィン切片を用いた手法の開発

开发使用石蜡切片观察蛋白质及其基因表达的方法

基本信息

批准号：
24930028
负责人：
山宮公子
金额：
$ 0.32万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24930028/
关键词：
プロサポシン精巣 In situ hybridization

项目摘要

目的:本研究は精巣におけるプロサポシン(PS)の精子形成に関する役割を明らかにする目的で、PSの動態について抗プロサポシン特異抗体を用いた免疫組織化学蛍光染色(免染)とDNAプローブを用いたIn situ hybridization(ISH)により観察したものである。PSはサポシンA,B,C,Dを含む524～527個のアミノ酸残基からなる前駆体タンパク質で、成長因子活性を有することが明らかになっている。通常はパラフィン切片による免染でPSの局在を、ISHでは凍結切片によるmRNAの分布を観察する。今回はパラフィン切片でもISHが可能か否かを比較検討した。免染:ラットに麻酔をし、経心還流固定後、精巣を採材しパラフィン切片を作成した。一次抗体と二次抗体と核染色にDAPIを用い、レーザー顕微鏡で染色強度を観察した。ISH:ラットに腹腔内注射で麻酔、精巣を採材、凍結後、凍結切片を作製した。合成オリゴDNAプローブを定法に従い、各プローブ3'末端に[α-^<35>S]dATPを標識した。各プローブを滴下し、一晩保温後、洗浄、脱水、暗室にて乳剤を塗布し、感光させた。現像後、ヘマトキシリン・エオジン染色をした。結果:免染ではPSが1日から4週までは曲精細管全体に、6週からは基底部に、12,16週では基底部、精子細胞、セルトリ細胞にも強く発現が見られた。4週では精粗細胞、12,16週では精粗細胞、精母細胞の核内にも粒状反応物が見られた。また、ISHでは4,8週の基底部にPSAS-1とPSAS-4のプローブに強い反応が見られ分泌型PSの産生が明らかとなった。以上からPSは精子形成に重要な役割があることが判明した。ISHでは、パラフィン切片でも凍結切片と同様の反応が見られたが、染め斑とパラフィンの残像が検鏡の妨げとなったので改良を加え、パラフィン切片でもより信頼性の高いISHができるようになった。

Objective: this study は fine 巣におけるプロサポシン (PS) の spermatogenesis に masato する "を cut Ming らかにする purpose で, PS の dynamic について resistance プロサポシをン specific antibody with いた immunohistochemical staining 蛍 light (exemption) と DNA プローブを with いた In situ hybridization(ISH)によによ観 cha たたであるである. PS はサポシン A, B, C, D を containing む 524 ~ 527 のアミノ acid residues からなる駆 body before タンパク qualitative で, growth factor activity をすることが Ming らかになっている. Usually, <s:1> パラフィ <s:1> sections による free from staining でPS slides are found in を, ISHで <s:1> frozen sections によるmRNA <s:1> distribution を観 observe する. This time, the パラフィパラフィ <s:1> slice でた ISHが might be を or no をを be more 検 about たた. Unstained :ラットに hemp 酔を <e:1> <e:1>, after passing through the heart flow for fixation, the fine brood を collected materials <s:1> パラフィ <s:1> sectioned を to make <s:1> た. An antibody と secondary antibody と nuclei に DAPI をい, レーザー顕 micromirror で staining intensity を観 examine した. ISH:ラットに intraperitoneal injection of で anesthetic 酔, sperm nests を for material collection, after freezing, and frozen sections を for preparation たた. DNA synthesis オリゴプローブを optional に従い, various プローブ 3 'end に [alpha ^ < > 35 S] dATP を logo した. Each プロブをブをブを drops プロ, keep warm overnight, wash clean, dehydrate, apply にて emulsion を in a dark room <s:1>, photosensitive させた. After the phenomenon, ヘトキシリトキシリエ · エジジ <s:1> staining をたた. Results: free dye では PS 1 がから 4 weeks までは curve all に seminiferous tubule, 6 weeks からは base に, dec 12 weeks では base, sperm cells, セルトリ cells にも strong く発が now see られた. At 4 weeks, で in the crude cells; at 12 and 16 weeks, で in the で in the crude cells; and in the nucleus of the spermatocytes, に応 granular antiplendents が are found in られた. また, ISH では 4, 8 weeks の base に PSAS 1 と PSAS - 4 のプローブにい reverse 応が see られ secretory type PS の produce が Ming らかとなった. The above があるらPS に important な factors in sperm formation にがあるたとが are determined to be た. ISH では, パラフィン slice でも frozen section と with others の anti 応が see られたが, dye め spot とパラフィンの afterimage が検 mirror の hinder げとなったので improved をえ, パラフィン slice でもより letter 頼の high い ISH ができるようになった.