タンパクとその遺伝子の発現を見る為のパラフィン切片を用いた手法の開発

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目的:本研究は精巣におけるプロサポシン(PS)の精子形成に関する役割を明らかにする目的で、PSの動態について抗プロサポシン特異抗体を用いた免疫組織化学蛍光染色(免染)とDNAプローブを用いたIn situ hybridization(ISH)により観察したものである。PSはサポシンA,B,C,Dを含む524～527個のアミノ酸残基からなる前駆体タンパク質で、成長因子活性を有することが明らかになっている。通常はパラフィン切片による免染でPSの局在を、ISHでは凍結切片によるmRNAの分布を観察する。今回はパラフィン切片でもISHが可能か否かを比較検討した。免染:ラットに麻酔をし、経心還流固定後、精巣を採材しパラフィン切片を作成した。一次抗体と二次抗体と核染色にDAPIを用い、レーザー顕微鏡で染色強度を観察した。ISH:ラットに腹腔内注射で麻酔、精巣を採材、凍結後、凍結切片を作製した。合成オリゴDNAプローブを定法に従い、各プローブ3'末端に[α-^<35>S]dATPを標識した。各プローブを滴下し、一晩保温後、洗浄、脱水、暗室にて乳剤を塗布し、感光させた。現像後、ヘマトキシリン・エオジン染色をした。結果:免染ではPSが1日から4週までは曲精細管全体に、6週からは基底部に、12,16週では基底部、精子細胞、セルトリ細胞にも強く発現が見られた。4週では精粗細胞、12,16週では精粗細胞、精母細胞の核内にも粒状反応物が見られた。また、ISHでは4,8週の基底部にPSAS-1とPSAS-4のプローブに強い反応が見られ分泌型PSの産生が明らかとなった。以上からPSは精子形成に重要な役割があることが判明した。ISHでは、パラフィン切片でも凍結切片と同様の反応が見られたが、染め斑とパラフィンの残像が検鏡の妨げとなったので改良を加え、パラフィン切片でもより信頼性の高いISHができるようになった。