副腎チトクロームP-450酵素活性とエピトープ解析

肾上腺细胞色素 P-450 酶活性和表位分析

• 批准号: 08770822
• 负责人: 浅輪 孝幸
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770822/
• 关键词: 21-hydroxylase; アジソン病; エピトープ; 自己抗体; 酵素活性

ステロイド21-OH遺伝子のpoint mutationは酵素活性を減弱させ、さらにPro453 mutationは21-OH自己抗体の結合にも影響を与えることを報告した。これに加えてin vitroでは21-OH自己抗体が21-OH酵素活性を阻害することも報告した。我々は21-OH遺伝子の5カ所の異なるpoint mutationをin vitro transcription/translarionシステムとイ-ストであるSaccharomyces cerevisiaeを用いてrecombinant proteinを作製した。そしてこれらと21-OH自己抗体の結合能を検討した。Human 21-OH cDNAをsite-directed mutagenesis法を用いてCys428Ser,Arg,Phe,Pro30Ser,IIe172Asnの5つのpoint mutationを作製した。Pro30,IIe172変異は自然界に存在し21-OH酵素欠損症の原因となっている。Cys428変異の報告は無いが、この部位はhaembindingに重要と考えられている。各種タンパクはSDS-PAGEで分析した後、自己免疫性アジソン病患者血清を用いてWestern blottingを実施した。コントロールとして健常人血清とrabbit 21-OH antibodyを使用した。^<35>Sでラベルした21-OHタンパクはimmunoprecipitation assayにて自己抗体との反応性を検討した。イ-ストに発現させた。Cys428変異タンパクは3つ共全て自己抗体との結合能が著しく阻害されていた。(Cys428Phe:88%,Cys428Arg:58%,Cys428Ser:39%)In vitroシステムにおいても同様に自己抗体結合能が阻害されていた。一方、Pro30Ser変異は抗体結合能に全く影響を与えなかった。IIe172Asnは僅かに結合能の低下を引き起こした。これらの研究結果より副腎21-OH自己抗体の結合部位は21-OH酵素活性部位と関連があり、C端と中心部位が重要であることが判明した。

The point mutation of Pro453-OH gene has been reported to decrease the enzyme activity of Pro453-OH gene. This is a report on the inhibition of 21-OH enzyme activity by 21-OH self antibodies. 5-point mutation of 21-OH protein in vitro transcription/translarion system The binding energy of 21-OH self-antibody was investigated. Human 21-OH cDNA site-directed mutagenesis was performed using Cys428Ser,Arg,Phe,Pro30Ser,IIe172Asn and five point mutations. Pro30,IIe172 is different from 21-OH enzyme deficiency existing in nature. Cys428 is different from the report. After SDS-PAGE analysis, Western blotting was performed on sera from patients with autoimmune diseases. Use of rabbit 21-OH antibody <35>S-21-OH-21-OH It's the first time I've seen it. Cys428 has a unique combination of antibodies and binding energy. (Cys428Phe: 88%, Cys428Arg: 58%, Cys428Ser:39%)In vitro chemistry, the same antibody binds to the same protein. One side, Pro30Ser, different antibody binding ability, all effects and IIe172Asn is only able to combine low energy. The results of this study indicate that the binding site of 21-OH self-antibody in accessory kidney is related to the active site of 21-OH enzyme, and the central site is important.

项目成果

T Asawa,et al: "Effects on autoantibody binding of five point mutations in steroid 21-hydroxylase expressed in an in vitro transcription/translation system and in yeast." Journal of Endocrinology. 148. 63 (1996)

T Asawa 等人：“体外转录/翻译系统和酵母中表达的类固醇 21-羟化酶的五个点突变对自身抗体结合的影响。”

T Asawa,et al: "Steroid 21-hydroxylase autoantibodies-Measurements with a new immunoprecipitation assay." Journal of Endocrinology. 151. 2 (1996)

T Asawa 等人：“类固醇 21-羟化酶自身抗体 - 使用新的免疫沉淀测定进行测量。”