副腎チトクロームP-450酵素活性とエピトープ解析

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ステロイド21-OH遺伝子のpoint mutationは酵素活性を減弱させ、さらにPro453 mutationは21-OH自己抗体の結合にも影響を与えることを報告した。これに加えてin vitroでは21-OH自己抗体が21-OH酵素活性を阻害することも報告した。我々は21-OH遺伝子の5カ所の異なるpoint mutationをin vitro transcription/translarionシステムとイ-ストであるSaccharomyces cerevisiaeを用いてrecombinant proteinを作製した。そしてこれらと21-OH自己抗体の結合能を検討した。Human 21-OH cDNAをsite-directed mutagenesis法を用いてCys428Ser,Arg,Phe,Pro30Ser,IIe172Asnの5つのpoint mutationを作製した。Pro30,IIe172変異は自然界に存在し21-OH酵素欠損症の原因となっている。Cys428変異の報告は無いが、この部位はhaembindingに重要と考えられている。各種タンパクはSDS-PAGEで分析した後、自己免疫性アジソン病患者血清を用いてWestern blottingを実施した。コントロールとして健常人血清とrabbit 21-OH antibodyを使用した。^<35>Sでラベルした21-OHタンパクはimmunoprecipitation assayにて自己抗体との反応性を検討した。イ-ストに発現させた。Cys428変異タンパクは3つ共全て自己抗体との結合能が著しく阻害されていた。(Cys428Phe:88%,Cys428Arg:58%,Cys428Ser:39%)In vitroシステムにおいても同様に自己抗体結合能が阻害されていた。一方、Pro30Ser変異は抗体結合能に全く影響を与えなかった。IIe172Asnは僅かに結合能の低下を引き起こした。これらの研究結果より副腎21-OH自己抗体の結合部位は21-OH酵素活性部位と関連があり、C端と中心部位が重要であることが判明した。