バクテロイデス・フォーサイサスのBApNA分解酵素の精製と性質

福赛拟杆菌BApNA降解酶的纯化及性质

• 批准号: 08771646
• 负责人: 玉谷 香奈子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771646/
• 关键词: バクテロイデス・フォーサイサス; BApNA分解酵素; 歯周病

本研究では、歯周病原性細菌の一つであるBacteroides forsythusの産生するBApNA分解酵素を精製し、その酵素学的な性状を検討した。その結果、以下の様な事実が判明した。(1)酵素の局在を検討した結果、本酵素は細胞質画分にその大部分(60%)が存在した。(2)TNBSを用いた阻害試験では、intactな菌体には阻害が全く認められなかった。このことから、本酵素は菌体内部に存在し、外界へ露呈していないと考えられた。(3)精製した酵素は、SDS-pageでは、分子量59KDaのメインバンドとその他複数のバンドが認められ、Arg-CH_2Clによるアフィニティーブロッティングでは、59KDaのバンドのみ反応が認められた。(4)ゲル濾過による推定分子量は60KDaであった。(5)阻害試験の結果、Serine-thiol protease inhibitorのうち、Antipain,Leupeptinで阻害がみとめられ、α_1-Antitrypsin,Elastatinalでは阻害は起きなかった。Serine protease inhibitorのうち、TLCKで阻害が認められPMSFでは阻害は認められなかった。また、Thiol protease inhibitor,Trypsin inhibitor,Plasma protease inhibitorの3群のうちからは、阻害を示す物質を見いだせなかった。また、Thiol依存性も存在しなかった。(6)合成基質を用いた基質特異性試験から、本酵素はArg,Lysに特異的であることが判明した。(7)Angiotensin等の短鎖ペプチドの切断試験から、本酵素はペプチド鎖内のArgのC末端を切断するEndopeptidaseであると考えられた。(8)Casein,Gelatin等の蛋白に対する分解活性を証明することはできなかった。結論:本菌の産生するBApNA分解酵素はP.gingivalisのトリプシン様酵素とは、かなり性質が異なっており、むしろT.denticolaによく似ていると考えられた。このことは、本菌がP.gingivalisが存在する部位でよく検出されることと関係があるかもしれない。

在这项研究中，我们纯化了由牙周致病细菌菌菌Forsythus产生的BAPNA降解酶，并检查了其酶促性能。结果，揭示了以下事实：（1）由于检查酶的定位，该酶的大多数（60％）在细胞质级分中发现。 （2）使用TNB的抑制测试，在完整细菌中未观察到抑制作用。这表明该酶存在于细菌内部，并且不暴露于外界。 （3）在SDS-PAGE中发现了纯化的酶，SDS-PAGE是一个主带，分子量为59 kDa和其他几个频段，并且与Arg-CH_2Cl的亲和力印迹，仅确认具有59 kDa的频带。 （4）凝胶过滤的估计分子量为60 kDa。 （5）抑制测试表明，在丝氨酸 - 硫醇蛋白抑制剂中，通过抗蛋白酶和亮肽素检测到抑制作用，并且α_1-抗抗胰蛋白酶和弹性没有抑制。在丝氨酸蛋白酶抑制剂中，在TLCK中观察到抑制作用，并且在PMSF中观察到NO抑制作用。此外，在这三组中未发现显示抑制的物质：硫醇蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶抑制剂和血浆蛋白酶抑制剂。此外，没有硫醇依赖性。 （6）使用合成底物的底物特异性测试表明，该酶针对ARG和LYS。 （7）从血管紧张素等短链肽的裂解试验中，该酶被认为是一种内肽酶，可在肽链中裂解ARG的C末端。 （8）不可能证明针对酪蛋白和明胶等蛋白质的降解活性。结论：该细菌产生的BAPNA降解酶本质上与牙龈疟原虫的胰蛋白酶样酶有很大不同，被认为与牙霉菌更相似。这可能与以下事实有关：细菌通常在存在牙龈疟原虫的部位检测到。