クラスCβ-ラクタマーゼHelix8,9間ループの基質特異性に与える影響

C 类 β-内酰胺酶 Helix 8,9 interloop 对底物特异性的影响

基本信息

批准号：
08772079
负责人：
額賀路嘉
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

クラスCβ-ラクタマーゼのα8-α9間ループ構造へのアミノ酸挿入変異によるオキシイミノ系β-ラクタム剤への基質特異性拡張の要因を調べるために以下の2テーマで変異β-ラクタマーゼを作成し、解析を行なった。アミノ酸挿入数変化:210位Arg以後にAlaを1から4残基までそれぞれ挿入したAVRA,AVRAA,AVRAAA,AVRAAAAの配列を持つ変異酵素を作成した。精製酵素の酵素化学的解析より、挿入Ala数の上昇とともに段階的なオキシイミノ系β-ラクタム剤分解のκcatとKm値の上昇が観察さた。アズトレオナム分解反応中間体として2種類の不活化体が観察され、より安定性の高い不活化体の割合はκcat値の上昇に伴い低下した。アミノ酸挿入位置変化:α8-α9間は約50残基からなる長いループ領域である。GC1β-ラクタマーゼでの3アミノ酸挿入位置を含む5箇所にAla-Ala-Ala挿入を導入した変異遺伝子をそれぞれ作成した。GC1β-ラクタマーゼの変異部位と異なる位置へAla-Ala-Alaを挿入した変異遺伝子導入大腸菌でもオキシイミノ系β-ラクタム剤への基質特異性拡張が観察された。以上の結果からα8-9間ループ上の挿入変異はオキシイミノ系β-ラクタム剤を基質としたときのアシル中間体のコンフォメーションに影響を及ぼし、その安定性を低下させ分解活性を上昇させることが明らかとなった。またその範囲もGC1β-ラクタマーゼで報告した位置以外にα8-9間ループの広範囲にわたっており、α8-9間ループはアミノ酸置換のみならず挿入変異においても基質特異性拡張変異のホットスポットであることが明らかとなった。

为了研究通过氨基酸插入突变扩展到oxyiminoβ-内酰胺剂的因素，通过氨基酸插入突变到Cβ-内酰胺酶类的环间结构中，制备了突变的β-内酰胺酶，并在以下两个主题上进行分析。氨基酸插入数量的变化：在210位后，制备了具有Avra，Avraa，Avraaa和Avraaa序列的突变酶，分别插入了1至4个残基的ALA。纯化酶的酶促化学分析表明，随着插入的ALA的数量的增加，观察到了Oxyiminoβ-内酰胺降解的κCAT和KM值的逐渐增加。观察到两种类型的灭活产物作为Aztreonam分解反应的中间体，并且随着κCAT值的增加，稳定性较高的灭活产物的比例降低。氨基酸插入位置的变化：α8-α9是一个长循环区域，由约50个残基组成。引入ALA-ALA-ALA插入的突变基因是在含有GC1β-内酰胺酶3个氨基酸插入位置的五个位置创建的。在突变的转基因大肠杆菌中还观察到底物特异性扩展到oxyiminoβ-内酰胺，其中将Ala-Ala-Ala插入与GC1β-内酰胺酶突变位置不同的位置。从上面的结果中可以揭示出α8-9间环上的插入突变会影响酰基中间体的构象时，当使用oxyiminoβ-lactam剂作为底物，从而降低了其稳定性并增加了降解活性。该范围还涵盖了除GC1β-内酰胺酶中报道的α8-9环路的广泛范围，并且发现α8-9环是底物特异性扩张突变的热点，不仅在氨基酸取代中，而且在插入性突变中也是如此。