腸上皮細胞のバリアー機能と病態の発生に関する研究-新しい分子モーターbarmotinを中心とした機能解析-

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1. 共焦点レーザー顕微鏡を用いた、蛍光標識物質の細胞間透過性の半定量法を開発した。これを用いて、培養腸上皮細胞T84での培養条件の変化に伴うバリア機能とタイト結合関連蛋白、occludin、ZO-1、barmotin(7H6抗原)の消長を検討した。その結果、T84細胞のタイト結合でのbarmotinの発現には、細胞のbasolateral sideからの物質供給が必要であることが明らかとなった。2. APC遺伝子変異マウス(Min)は、腸管に多数のポリープを生じ、腺癌発生過程の解析に用いられている。Minマウスの空腸ポリープでのタイト結合関連蛋白の発現・局在を観察し、同時に、摘出したポリープに対する種々の分子量のFITC-dextran溶液の透過性を共焦点レーザー顕微鏡で観察し、タイト結合バリア機能をin situで検討した。その結果、同一ポリープにおいて、高分化腺癌部では、各タイト結合関連蛋白の発現は正常小腸上皮とほぼ同様の発現を示し、物質透過性の亢進も認められなかったが、低分化腺癌部では、タイト結合関連蛋白の発現は著明に低下し、物質透過性は選択的に亢進した。このことから、腸腺癌の悪性化過程において、タイト結合関連蛋白の発現異常とタイト結合バリア機能の低下が相関することが示された。3. タイト結合蛋白occludinはそのアミノ酸配列から、二つの細胞外ドメインをもつと考えられている。我々は、これらのドメインの機能解析を目的として、とラットoccludinの細胞外ドメイン持異抗体を作製した。得られた抗体により、occludin transfected-RLE細胞およびMDCK細胞の未固定状態での免疫染色で細胞間に線状の染色性を認めたことから、occludinの二つのドメインが細胞外に局在することが証明された。