プラスミドRts1複製開始蛋白RepAの機能と蛋白間相互作用に関する研究

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1. トリプシンによる精製RepA蛋白の部分分解。RepA蛋白はDNA結合能および蛋白間の相互作用など、いろいろな機能をドメインとして持っていることが予想されている。トリプシンを用いた部分分解実験より、野生型のRepA蛋白はSer_<48>とLeu_<206>の直前に消化されやすい部位があることがわかった。また複製開始能は失っているがDNA結合能は保持している変異体RepA蛋白z279でも同様の結果を得た。P1ファージとRts1のRepA蛋白はお互いに非常に高い相同性をもっているが、両者間のキメラ蛋白を用いたin vivoの実験から、このLeu_<206>よりN末端側はDNA結合に寄与し、C末端側はinc活性に関わっていることが示された。inc活性は蛋白間の相互作用と考えられているので、N末端側はDNAに、C末端側は蛋白に、それぞれ作用していると考えられる。このことはドメイン構造を強く示唆する。2. ドメイン構造を持つと予想される断片の合成。トリプシン部分分解部位を用いて機能的ドメインの検討を行った。断片化された蛋白のみをコードするようにDNAをPCRで合成し、ヒスチジンタグ融合蛋白として発現できるように設計した。各断片がin vivoあるいはin vitroでどのような作用を持っているのか、クロスリンキング、DNA結合実験、in vivo複製能について現在検討中である。3. Rts1プラスミドの全塩基配列決定の試み。プラスミドの全体像を明らかにすることは、複製開始機構の位置づけ並びにゲノムとしてのプラスミドの特性の解析として重要である。そのため全塩基配列を解読する目的でプラスミドDNAの制限酵素地図を作製した。Rts1プラスミドDNAはNheI,XbaI,SpeIにて4-7個の断片に切断され、各断片の合計から全体の大きさは約210kbであると推測された。