膵分泌型炭酸脱水酸素の遺伝子クローニングと膵管内自己防御機構における意義

胰腺分泌性碳酸脱水氧基因克隆及其在胰腺导管自卫机制中的意义

• 批准号: 09770363
• 负责人: 西森 功
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kochi Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770363/
• 关键词: 膵臓; 炭酸脱水酵素; mRNA; cDNA; 遺伝子クローニング; アイソザイム; 慢性膵炎

ヒト膵臓における炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase,CA)の遺伝子発現を検討し下記の結果を得た。1, ヒト膵管細胞および腺房細胞由来の培養癌細胞株でCA2(細胞質型)、CA4(膜結合型)、CA6(分泌型)の3つのCAアイソザイムmRNAの発現をRT-PCR-Southern blot法により検討した結果、膵管細胞癌ではCA2およびCA4の発現がみられ、腺房細胞癌ではCA6の発現が認められた。これらの結果よりヒト膵臓では腺房細胞にCA6が、膵管細胞にCA2およびCA4が存在することが示唆された。2, RT-PCRを用いたhomology probing法によりヒト膵臓のpolyA+RNAから得た新しいCAアイソザイム(CA5B)の生化学的特徴を詳細に検討した。得られたcDNAは1182bpで317アミノ酸をコードし、このアミノ酸から予想される分子量は36.4kDaであった。既報のCAアイソザイムとの相同性を検討した結果、cDNAおよびアミノ酸配列においてCA5A(ミトコンドリアCA)と最も高い相同性がみられた。N末端には疎水性に富むシグナル配列(33残基)がみられ、CA5Bを発現させたCOS-7細胞の細胞構成成分の分画中における酵素活性測定、green fluorescent蛋白とCA5Bの融合蛋白を発現させたCOS-7細胞の蛍光顕微鏡による観察で、CA5Bは新しいミトコンドリアCAアイソザイムと考えられた。また、CA5B遺伝子組み替え蛋白を用いたWestern blot法により、CA5Bのprecursor蛋白およびmature蛋白の分子量は各々36kDa、32kDaであった。CA5Bの酵素活性はCA2(高活性CA)の約1%であった。Northern blotではtranscriptの大きさは約1.3kbで、心筋および骨格筋でmRNAの発現がみられた。RT-PCR法では膵臓、腎臓、唾液腺、脊髄におけるmRNA発現がみられた。以上の結果より、CA5Bは新しいミトコンドリアCAアイソザイムであることが示され、ヒト膵臓における発現が確認された。

The results of this study are summarized below. 1. The expression of CA2 and CA4 mRNA was detected by RT-PCR-Southern blot in cultured cancer cell lines derived from ductal and glandular cells. CA2 and CA4 mRNA were detected in ductal and glandular cell carcinomas, and CA6 mRNA was detected in glandular cell carcinomas. The results showed that CA6, CA2 and CA4 were present in both cells. 2. RT-PCR was used to investigate the biochemical characteristics of CA5B in detail. The obtained cDNA has a molecular weight of 36.4 kDa at 1182bp. The results of the identity analysis of the reported CA sequences show that the cDNA sequences are similar to those of the CA5A sequences. The N-terminal amino acid sequence (33 residues) was detected, CA5B was detected, and COS-7 cells were analyzed for its cellular components. Enzyme activity assay, green fluorescent protein and CA5B fusion protein detection, and COS-7 cells were examined by light microscopy. CA5B was detected. The molecular weights of CA5B precursor protein and mature protein were 36kDa and 32kDa respectively by Western blot. CA5B enzyme activity is about 1% of CA2(high activity CA). Northern blot analysis showed that the mRNA expression of the transcript was about 1.3kb. RT-PCR method was used to detect mRNA expression in kidney, salivary gland and spinal cord. The above results show that CA5B is a new type of equipment.

项目成果

Kiyomi,Fujikawa-Adachi: "Identification of carbonic anhydrase IV and VI mRNA expression in human pancreas and salivary glands." Pancreas. (1999)

Kiyomi，Fujikawa-Adachi：“人胰腺和唾液腺中碳酸酐酶 IV 和 VI mRNA 表达的鉴定。”