尿路結石に対する遺伝子治療についての研究

1. 平成9年度は、アンチセンスDNA分子の合成および精製を行うとともに、MDCK細胞を用いた実験系でosteopontin(OPN)-mRNAの発現がどの程度抑制されるかについて検討した。(1) MDCK細胞よりtotal RNAを抽出して、Rapid Amplification of cDNA End法によりMDCK細胞内OPNの塩基配列を決定した。(2) 塩基配列をもとにmRNA以下の翻訳レベルを抑制させるantisense oligonucleotide、それに対するsense oligonuclcotideをATGを含む66baseから20塩基作製した。(3) 2×10^6cellsのMDCK細胞をconfluentまで培養後、遺伝子導入試薬DOTAPとantisenseoligonucleotide、sense oligonucleotideをそれぞれ加え10時間培養した。(4) その後、OPNの発現抑制を蛍光抗体法で確認した。(5) OPN蛋白発現はantisense oligonucleotide投与にて20μM以上の濃度で抑制された。遺伝子レベルで特異的にOPNのみの発現を抑制することにより結石形成は抑制され、将来的に遺伝子治療へと発展するものと考えられる。2. 平成10年度は、アンチセンスDNA分子を結石形成ラットに投与して腎OPN-mRNAの発現に与える影響について検討するとともに、結石形成ラットの腎組織切片標本を作製する予定であった。(1) アンチセンスDNA分子を結石形成ラットに投与する方法が手技的に非常に困難であったため、腎OPN-mRNAの発現に与える影響についてまでは検討できなかった。(2) 現在、別の投与方法を検討中であり、今後これが成功すれば結石形成ラットの腎組織切片標本を作製して比較検討する予定である。

1. 平成9年度は、アンチセンスDNA分子の合成および精製を行うとともに、MDCK細胞を用いた実験系でosteopontin(OPN)-mRNAの発現がどの程度抑制されるかについて検討した。(1) MDCK細胞よりtotal RNAを抽出して、Rapid Amplification of cDNA End法によりMDCK細胞内OPNの塩基配列を決定した。(2) 塩基配列をもとにmRNA以下の翻訳レベルを抑制させるantisense oligonucleotide、それに対するsense oligonuclcotideをATGを含む66baseから20塩基作製した。(3) 2×10^6cellsのMDCK細胞をconfluentまで培養後、遺伝子導入試薬DOTAPとantisenseoligonucleotide、sense oligonucleotideをそれぞれ加え10時間培養した。(4) その後、OPNの発現抑制を蛍光抗体法で確認した。(5) OPN蛋白発現はantisense oligonucleotide投与にて20μM以上の濃度で抑制された。遺伝子レベルで特異的にOPNのみの発現を抑制することにより結石形成は抑制され、将来的に遺伝子治療へと発展するものと考えられる。2. 平成10年度は、アンチセンスDNA分子を結石形成ラットに投与して腎OPN-mRNAの発現に与える影響について検討するとともに、結石形成ラットの腎組織切片標本を作製する予定であった。(1) アンチセンスDNA分子を結石形成ラットに投与する方法が手技的に非常に困難であったため、腎OPN-mRNAの発現に与える影響についてまでは検討できなかった。(2) 現在、別の投与方法を検討中であり、今後これが成功すれば結石形成ラットの腎組織切片標本を作製して比較検討する予定である。