酸化的ピリミジン塩基損傷を修復する新規酵素の探索

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放射線の生物影響は、主として放射線が細胞内の水を励起して発生させる各種活性酸素種によるものとされている。よって放射線によるDNA損傷は主として酸化的損傷であるが、活性酸素種は呼吸等の酸素を利用する代謝過程においても副産物として発生する。よって生物はそれらの酸化的DNA損傷を修復する経路を発展させ進化してきた。本研究では、大腸菌においてピリミジンの酸化損傷であるチミングリコールの修復酵素としてEndoIIIおよびEndoVIII以外の新規修復酵素の単離を目的に、酸化的DNA損傷に対する新しい修復活性の検出を試みた。実験はまず、基質DNAとしてオリゴヌクレオチドの特定の部位に特定の損傷塩基を導入したものを作製した。EndoIIIおよびEndoVIIIはいずれも単一欠損では表現型がでず、またEndoVIIIの活性はEndoIIIの活性に隠れてしまうことから、新規修復酵素活性は更に検出が困難であると考えられた。そこで水素化ホウ素ナトリウムによる反応中間体のトラップ実験により微量な活性を検出することとした。その予備実験として、岡山大の関らがクローニングしたマウスのEndoIIIホモログにおいてEndoIIIと同様に反応中間体のトラップができるかどうかを検討した。EndoIIIについてはこれまでシッフ塩基反応中間体が水素化ホウ素ナトリウムの還元作用により共有結合化され安定な反応中間体を形成することが確認されている。実験の結果、マウスホモログも同様に安定な反応中間体を形成することがわかり、機能的にもEndoIIIのホモログであることが証明された。また実験条件検討の結果、この検出法が従来法と比較して高感度であること、また粗精製サンプル中において、ピークフラクションの特定が容易であることから最終目的であるチミングリコールに対する新規な修復酵素の検出法が確立された。