ウシにおけるレプチンのアッセイ系確立と泌乳との関係

昨年度に引き続き、組み替え型ウシレプチンの合成を行った。昨年度中にGST融合型ウシレプチンと思われるタンパク質の発現は確認していたものの、そのほとんどが不溶性分画に存在した。本年度、様々な培養・発現条件の検討を行ったが、可溶性を向上させることが出来なかった。そこで発現ベクターと大腸菌を共に変更したところ、良好な発現と、可溶性の向上を認めるに至った。現在、組み替え型タンパク質の抽出・精製条件を検討中である。1.pGEX-4T-1 (Pharmacia) /BL2137℃、0.7mM lPTGにて発現を確認していたので、培養温度の低下(26℃)、lPTG濃度の減少(0.1mM,0.3mM)、エアロレーションの改善等により可溶性の向上を試みた。また超音波による大腸菌の破砕やプロテアーゼインヒビターの濃度にも注意し、発現・抽出を行ったが、改善は認められなかった.。2.pMAL-cRl (New England Biolabs) /BL21(DE3)そこで、GSTよりも一般に可溶性が高いと言われるMBP融合型の発現ベクター(pMAL-cRl)に変更し、宿主大腸菌も、チオレドキシンを発現している株(BL21(DE3))に変更した。そして、26℃、0.3mM IPTG、230rpmにて発現誘導を試みたところ、良好なMBP融合型タンパク質の発現を認めた。依然不溶性分画にも存在するものの、MBP融合型ウシレプチンと思われるタンパク質が、可溶性分画に多量に存在する事をSDS-PAGEにて確認した。今後、アミロースレジンやファクターXaを用いて、組み替え型ウシレプチンを抽出・精製し、ウシ特異的レプチン抗体の作成等行っていく予定である。

昨年度に引き続き、組み替え型ウシレプチンの合成を行った。昨年度中にGST融合型ウシレプチンと思われるタンパク質の発現は確認していたものの、そのほとんどが不溶性分画に存在した。本年度、様々な培養・発現条件の検討を行ったが、可溶性を向上させることが出来なかった。そこで発現ベクターと大腸菌を共に変更したところ、良好な発現と、可溶性の向上を認めるに至った。現在、組み替え型タンパク質の抽出・精製条件を検討中である。1.pGEX-4T-1 (Pharmacia) /BL2137℃、0.7mM lPTGにて発現を確認していたので、培養温度の低下(26℃)、lPTG濃度の減少(0.1mM,0.3mM)、エアロレーションの改善等により可溶性の向上を試みた。また超音波による大腸菌の破砕やプロテアーゼインヒビターの濃度にも注意し、発現・抽出を行ったが、改善は認められなかった.。2.pMAL-cRl (New England Biolabs) /BL21(DE3)そこで、GSTよりも一般に可溶性が高いと言われるMBP融合型の発現ベクター(pMAL-cRl)に変更し、宿主大腸菌も、チオレドキシンを発現している株(BL21(DE3))に変更した。そして、26℃、0.3mM IPTG、230rpmにて発現誘導を試みたところ、良好なMBP融合型タンパク質の発現を認めた。依然不溶性分画にも存在するものの、MBP融合型ウシレプチンと思われるタンパク質が、可溶性分画に多量に存在する事をSDS-PAGEにて確認した。今後、アミロースレジンやファクターXaを用いて、組み替え型ウシレプチンを抽出・精製し、ウシ特異的レプチン抗体の作成等行っていく予定である。