5-HT_<2A>受容体共役情報伝達系を介するβ_1アドレナリン受容体遺伝子発現抑制機構

1)平成12年度の実験から、PKCを介したβ_1受容体転写抑制には、翻訳開始点の5'上流-403/-340の領域が関与しており、-352/-345に存在するCRE類似配列が重要であることが明らかになった。2)CRE類似配列を含む領域(-364/-337)をプローブに用いたゲルシフトアッセイから、CRE類似配列に結合する転写因子はCREBであることが示唆された。この結果は精製ヒトCREBを用いた実験からも支持された。3)抗CREB抗体存在下にゲルシフトアッセイを行うと、スーパーシフトが観察され、CRE類似配列に結合する転写因子がCREBであることが明らかになった。4)SY5Y細胞核抽出物を用いたDNase Iフットプリンティングアッセイの結果、CRE類似配列に結合する転写因子はCREBであった。この時、CRE類似配列近傍に結合し、CREBと強調的に作用すると考えられる転写因子は検出できなかった。5)5-HT_<2A>受容体刺激に続くPKC活性化により、リン酸化CREBが増加するものと思われる。一般にCREBのリン酸化は、CREBのCREへの結合には影響を及ぼさないが、リン酸化CREBと他の転写(調節)因子との相互作用が高まり、結果的に遺伝子転写は促進する。しかし今回の実験では、PKC活性化に伴いβ_1受容体遺伝子は、むしろ、抑制された。今回の実験では、CRE類似配列近傍に結合するCREBと協調的に作用する転写因子は見出せなかった。しかし、β_1受容体遺伝子の基本転写活性には、CRE類似配列およびそれより5'側の配列が必要である。従って、今回のDNase Iフットプリンティングアッセイの条件下では検出できなかった可能性があるが、CREBと協調的に作用する転写因子が、PKCによるリン酸化を受け、CREBとの結合(直接あるいは間接的な結合)が抑制され、結果的にβ_1受容体遺伝子転写活性が減少した可能性が考えられた。

1)平成12年度の実験から、PKCを介したβ_1受容体転写抑制には、翻訳開始点の5'上流-403/-340の領域が関与しており、-352/-345に存在するCRE類似配列が重要であることが明らかになった。2)CRE類似配列を含む領域(-364/-337)をプローブに用いたゲルシフトアッセイから、CRE類似配列に結合する転写因子はCREBであることが示唆された。この結果は精製ヒトCREBを用いた実験からも支持された。3)抗CREB抗体存在下にゲルシフトアッセイを行うと、スーパーシフトが観察され、CRE類似配列に結合する転写因子がCREBであることが明らかになった。4)SY5Y細胞核抽出物を用いたDNase Iフットプリンティングアッセイの結果、CRE類似配列に結合する転写因子はCREBであった。この時、CRE類似配列近傍に結合し、CREBと強調的に作用すると考えられる転写因子は検出できなかった。5)5-HT_<2A>受容体刺激に続くPKC活性化により、リン酸化CREBが増加するものと思われる。一般にCREBのリン酸化は、CREBのCREへの結合には影響を及ぼさないが、リン酸化CREBと他の転写(調節)因子との相互作用が高まり、結果的に遺伝子転写は促進する。しかし今回の実験では、PKC活性化に伴いβ_1受容体遺伝子は、むしろ、抑制された。今回の実験では、CRE類似配列近傍に結合するCREBと協調的に作用する転写因子は見出せなかった。しかし、β_1受容体遺伝子の基本転写活性には、CRE類似配列およびそれより5'側の配列が必要である。従って、今回のDNase Iフットプリンティングアッセイの条件下では検出できなかった可能性があるが、CREBと協調的に作用する転写因子が、PKCによるリン酸化を受け、CREBとの結合(直接あるいは間接的な結合)が抑制され、結果的にβ_1受容体遺伝子転写活性が減少した可能性が考えられた。