マウス精子形成において半数体精子細胞特異的に発現する新規遺伝子の機能の解明

TISP40遺伝子の精細胞内での存在について明らかにするTISP40遺伝子の発現様式を確認するため、マウスの種々の組織のRNAをメンブレンにブロットしたもの、またマウスが生まれてから成熟した精子を形成するまで(35日齢)を2-5,8,17,23,29,35の6つに分けてそれぞ.れ精巣からRNAを採取し、メンブレンにブロットしたものとを用いてNorthern解析を行ったところ、精巣組織のみにまた23日齢以降に発現が認められた。さらにTISP40 mRNAが強く発現しているgerm cellsのdevelopmental stageを決定するために、TISP40 cDNAから生成したアンチセンスおよびセンスcRNAプローブと成体マウスの精巣を用いてin situ hybridizationを行ったところ、Stage V〜VIIIにおいて発現が認められた。この結果はNorthern解析の結果と同調していた。TISP40蛋白をGST融合タンパク質として大腸菌を用いて大量発現させ、GST-TISP40融合蛋白として精製した後、ラビットに免疫しポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体の品質確認した後、抗体を用いて免疫染色を行ったところ、精巣内でのTISP40蛋白の発現はstep14〜16において認められた。このことはmRNAと蛋白の発現「転写と翻訳」におよそ1週間のタイムラグがあることを示した。また細胞内局在については精子の核部にあることを明らかにした。TISP40遺伝子が転写制御因子として機能しているか明らかにするSAAB法を用いてTISP40蛋白に結合するDNA配列を決定し、その配列を用いてGel shift assayを行う。さらにTISP40遺伝子のノックアウトマウスを作製することで、その機能の詳細について明らかにすることを目指している。TISP40近傍のgenomeは採得した。そして得られたgenome上でTISP40遺伝子をdisruptし、ノックアウトマウス作製のためのコンストラクトを作成中である。マウスES細胞中にてgenome上でうまくTISP40遺伝子がdisruptされていることをPCRで確認した後、当微生物病研究所・遺伝子組み換え研究分野と共同研究としてノックアウトマウス作製を目指す。TISP40遺伝子が他のTISP遺伝子とどのように関わるかを明らかにするノックアウトマウスができ次第、解析に入りたい。うまく表現形が出ると仮定する場合、その点についてさらに詳しい解析に入る。表現形が出なかった場合には、ノックアウトマウスより採取した精巣のRNAを用いて、現在まで申請者らが得たTISP遺伝子80種類についてNorthern解析を行い、それら遺伝子がTISP40遺伝子の上流あるいは下流にあるかを明らかにすることで、TISP40遺伝子の機能について検索する。

TISP40遺伝子の精細胞内での存在について明らかにするTISP40遺伝子の発現様式を確認するため、マウスの種々の組織のRNAをメンブレンにブロットしたもの、またマウスが生まれてから成熟した精子を形成するまで(35日齢)を2-5,8,17,23,29,35の6つに分けてそれぞ.れ精巣からRNAを採取し、メンブレンにブロットしたものとを用いてNorthern解析を行ったところ、精巣組織のみにまた23日齢以降に発現が認められた。さらにTISP40 mRNAが強く発現しているgerm cellsのdevelopmental stageを決定するために、TISP40 cDNAから生成したアンチセンスおよびセンスcRNAプローブと成体マウスの精巣を用いてin situ hybridizationを行ったところ、Stage V〜VIIIにおいて発現が認められた。この結果はNorthern解析の結果と同調していた。TISP40蛋白をGST融合タンパク質として大腸菌を用いて大量発現させ、GST-TISP40融合蛋白として精製した後、ラビットに免疫しポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体の品質確認した後、抗体を用いて免疫染色を行ったところ、精巣内でのTISP40蛋白の発現はstep14〜16において認められた。このことはmRNAと蛋白の発現「転写と翻訳」におよそ1週間のタイムラグがあることを示した。また細胞内局在については精子の核部にあることを明らかにした。TISP40遺伝子が転写制御因子として機能しているか明らかにするSAAB法を用いてTISP40蛋白に結合するDNA配列を決定し、その配列を用いてGel shift assayを行う。さらにTISP40遺伝子のノックアウトマウスを作製することで、その機能の詳細について明らかにすることを目指している。TISP40近傍のgenomeは採得した。そして得られたgenome上でTISP40遺伝子をdisruptし、ノックアウトマウス作製のためのコンストラクトを作成中である。マウスES細胞中にてgenome上でうまくTISP40遺伝子がdisruptされていることをPCRで確認した後、当微生物病研究所・遺伝子組み換え研究分野と共同研究としてノックアウトマウス作製を目指す。TISP40遺伝子が他のTISP遺伝子とどのように関わるかを明らかにするノックアウトマウスができ次第、解析に入りたい。うまく表現形が出ると仮定する場合、その点についてさらに詳しい解析に入る。表現形が出なかった場合には、ノックアウトマウスより採取した精巣のRNAを用いて、現在まで申請者らが得たTISP遺伝子80種類についてNorthern解析を行い、それら遺伝子がTISP40遺伝子の上流あるいは下流にあるかを明らかにすることで、TISP40遺伝子の機能について検索する。