リボザイム誘導システムを具備する細胞・個体レベルの遺伝子発現調節実験系の開発

特定の遺伝子の発現をテトラサイクリンにより誘導するシステム(Tet-System)を用い、培養細胞又は動物個体におけるリボザイムの発現の時期、量などを外部から調節できる系を確立する研究を行った。マウスのインスリン遺伝子をターゲットとした、アンチ・マウスインスリン人工リボザイムを構築し、これらのリボザイムがin vitroで特定の基質RNAを切断することを確認した。また、インスリンを分泌する培養細胞Min-6に導入し、細胞のインスリン分泌量の変化によりリボザイム活性を判定したところ、リボザイム導入細胞のインスリン分泌量が非導入細胞に比べ、抑制されていることが示唆されるデータが得られている。一方、動物個体内で発現調節系を作動させるため、マイクロインジェクションにより、Tet-System及び誘導対象となる遺伝子(RibozymeまたはLuciferase)をそれぞれ組み込んだトランスジェニック(Tg)マウスの作製を試みトランスジーンの導入が確認されたマウスと、これらをC57BL/6J Jclマウスと交配したF1個体を得た。このF1同士をさらに交配し、Tet-System及び誘導対象の両者を持つTgマウスを作製し、これらについて解析を行った。Tet-System導入マウスに適当濃度の誘導剤(Tetracyclin, Doxicyclin)を経口にて与え、適当な時期にマウス尻尾の一部又は血液を採取し、必要な蛋白質分画を抽出した。この抽出物を用いて、ウエスタンブロッティング、Luciferase Assay等を行い、経時的変化を見ることにより導入遺伝子の活性、発現量及び発現誘導の応答性を解析した。さらに、in vitro及び培養細胞実験系で実現したTet-Systemとリボザイムによる目的遺伝子の発現調節を、マウス個体において再現する系を引き続き検討している。

特定の遺伝子の発現をテトラサイクリンにより誘導するシステム(Tet-System)を用い、培養細胞又は動物個体におけるリボザイムの発現の時期、量などを外部から調節できる系を確立する研究を行った。マウスのインスリン遺伝子をターゲットとした、アンチ・マウスインスリン人工リボザイムを構築し、これらのリボザイムがin vitroで特定の基質RNAを切断することを確認した。また、インスリンを分泌する培養細胞Min-6に導入し、細胞のインスリン分泌量の変化によりリボザイム活性を判定したところ、リボザイム導入細胞のインスリン分泌量が非導入細胞に比べ、抑制されていることが示唆されるデータが得られている。一方、動物個体内で発現調節系を作動させるため、マイクロインジェクションにより、Tet-System及び誘導対象となる遺伝子(RibozymeまたはLuciferase)をそれぞれ組み込んだトランスジェニック(Tg)マウスの作製を試みトランスジーンの導入が確認されたマウスと、これらをC57BL/6J Jclマウスと交配したF1個体を得た。このF1同士をさらに交配し、Tet-System及び誘導対象の両者を持つTgマウスを作製し、これらについて解析を行った。Tet-System導入マウスに適当濃度の誘導剤(Tetracyclin, Doxicyclin)を経口にて与え、適当な時期にマウス尻尾の一部又は血液を採取し、必要な蛋白質分画を抽出した。この抽出物を用いて、ウエスタンブロッティング、Luciferase Assay等を行い、経時的変化を見ることにより導入遺伝子の活性、発現量及び発現誘導の応答性を解析した。さらに、in vitro及び培養細胞実験系で実現したTet-Systemとリボザイムによる目的遺伝子の発現調節を、マウス個体において再現する系を引き続き検討している。