遺伝子変異をもちいた呼吸調節のメカニズムの解析

利用基因突变分析呼吸调节机制

• 批准号: 13877253
• 负责人: 西野 卓
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877253/
• 关键词: 低酸素応答; 遺伝子発現; GFP; 細胞株; 低酸素; 応答; 遺伝子; エリスロポイエチン; エンハンサー; プロモーター; 発現

酸素は生体にとって必須のものであり低酸素状態においてはこれを克服するため様々な応答をする。これらは個体、各臓器、構成する細胞の応答と細分化することができるが、逆に細胞を用いた研究からの知見を臓器、個体へと還元し臨床応用可能なものへと発展させることが可能であろう。このような観点から我々は培養細胞を用いて研究を行っている。この際、細胞の低酸素応答が生きたまま目で見ることができれば有用であろうと考えそのような細胞の作成を試みてきた。応答の可視化のためには緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いている。これはクラゲ由来のタンパク質で、この遺伝子を人為的に発現させるとそのタンパク質をもつ細胞は蛍光下に緑色に光る。我々はその発現を低酸素に対する遺伝子応答と関連させた。【方法】血管内皮増殖因子の遺伝子発現調節領域にある低酸素誘導因子の結合モチーフを合成し5個繰り返したものを作成、エンハンサーとした。またCMVプロモーターより最小機能単位をPCR法により増幅しプロモーターとした。これらがEGFPのcDNAの上流に位置するよう組み込まれたコンストラクトを作成しHeLa細胞に導入した。さらに薬剤による選択を行い、二つの細胞株を樹立した。【結果】これらの細胞は2%酸素下に半日から一日培養すると、蛍光顕微鏡下に緑色に光る。その後20%酸素下に数日培養することにより元に戻る。この反応は繰り返すことができ、また、凍結保存、解凍、培養、再度の実験が可能であった。4%酸素下ではこの応答は観察されない。定量性については検討中である。

The acidin <s:1> organism にとって must be in a low-acidin state にお て て <s:1> れを れを れを れを to overcome するため and 々な応 answer をする. こ れ ら は individuals, each viscera, constitute す る cells の 応 answer と differentiation す る こ と が で き る が, inverse に cells を い た research か ら の knowledge を viscera, individual へ と yuan し clinical 応 also use may な も の へ と 発 exhibition さ せ る こ と が may で あ ろ う. Youdaoplaceholder2 ような観 point ら I 々 々 culture cells を use て て to study を line って る る る. こ の interstate, cells の low acid element 応 answer が き た ま ま で see る こ と が で き れ ば useful で あ ろ う と exam え そ の よ う の な cells into を try み て き た. Youdaoplaceholder0 answer: visualization of 応 ために ために green 蛍 light タ タ パ パ light (GFP)を using て て る る. こ れ は ク ラ ゲ origin の タ ン パ ク で, こ の posthumous son 伝 を man-made に 発 now さ せ る と そ の タ ン パ ク qualitative を も つ cells は 蛍 light る に に green light. I 々 は そ の 発 now を low acid element に す seaborne る heritage 伝 son 応 answer と masato even さ せ た. 【 method 】 vascular endothelial raised colonization factor の heritage 伝 son 発 now adjust field に あ る low acid element factor の モ チ ー フ を synthetic し five Qiao り return し た も の, エ を ン ハ ン サ ー と し た. ま た CMV プ ロ モ ー タ ー よ り 単 a minimum function を PCR method に よ り rights of し プ ロ モ ー タ ー と し た. こ れ ら が EGFP の cDNA の upper position に す る よ う group み 込 ま れ た コ ン ス ト ラ ク ト を made し HeLa に import し た. For the さらに drug による, select the 択を row さらに, and for the two による <s:1> cell lines を, establish the <s:1>. 【 results 】 こ れ ら の cells は 2% acid element under に semidiurnal か ら day training す る と, 蛍 顕 light microscopically る に に green light. After そ そ, 20% acid was used for に several days to culture する とによ とによ mononies に戻る. <s:1> <s:1> reverse 応 to return す とがで とがで す, また, freeze and preserve, thaw, cultivate, re-<s:1> experiment が possible であった. Under 4% acid, there are で, で,, 応, 応, 観, and されな. Quantitative に に に て て 検 検 である.