ハイブリッド染色体キャリヤーの開発とトランスジェニック鳥類作製への応用

前年度における研究で、ハイブリッド染色体キャリヤーを使ってオボアルブミンプロモーターによって目的遺伝子を発現させるために、オボアルブミン遺伝子座へ相同組換えするためのベクターとして、オボアルブミンプロモーター領域とオボアルブミン構成遺伝子領域に挟んだ形でまず薬剤耐性遺伝子の発現カセットを組み込んだ後、薬剤耐性遺伝子発現カセットの上流にオボアルブミンプロモーターの制御によって発現するように目的遺伝子を導入したプラスミドベクターを作製した。今回、モデル目的遺伝子として、ヒト成長ホルモン遺伝子を用いたベクターをDT-40細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し、薬剤による選択でヒト成長ホルモン遺伝子が導入された細胞をスクリーニングした。PCR法による解析によってヒト成長ホルモン遺伝子がオボアルブミンプロモーター部位に挿入されていることを確認できた。遺伝子導入したDT-40細胞のコルセミド/サイトカラシンB処理によるミクロセル化誘導のための条件(濃度・誘導時間)検討を行い、密度勾配遠心によってミクロセルの回収が行えるかを調べたところ、まだ効率は低いもののミクロセルの回収が行えた。ハイブリッド染色体キャリヤーを誘導するためには、コルセミド/サイトカラシンB処理によるDT-40細胞のミクロセル誘導の前に、VSV-G発現ベクターの導入によってDT-40細胞膜上にVSV-Gを一過的に高発現させる必要があるので、VSV-G遺伝子導入条件やミクロセル化のタイミングの条件を検討した。これまでエレクトロポレーション法では高効率の遺伝子導入が困難であったため、今回はリポフェクション法によるDT-40細胞への遺伝子導入を行ったが、今のところ遺伝子導入効率があまり上がらず、今後も高効率にDT-40細胞へ遺伝子導入できるリポフェクション試薬のスクリーニングを行う必要がある。

前年度における研究で、ハイブリッド染色体キャリヤーを使ってオボアルブミンプロモーターによって目的遺伝子を発現させるために、オボアルブミン遺伝子座へ相同組換えするためのベクターとして、オボアルブミンプロモーター領域とオボアルブミン構成遺伝子領域に挟んだ形でまず薬剤耐性遺伝子の発現カセットを組み込んだ後、薬剤耐性遺伝子発現カセットの上流にオボアルブミンプロモーターの制御によって発現するように目的遺伝子を導入したプラスミドベクターを作製した。今回、モデル目的遺伝子として、ヒト成長ホルモン遺伝子を用いたベクターをDT-40細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し、薬剤による選択でヒト成長ホルモン遺伝子が導入された細胞をスクリーニングした。PCR法による解析によってヒト成長ホルモン遺伝子がオボアルブミンプロモーター部位に挿入されていることを確認できた。遺伝子導入したDT-40細胞のコルセミド/サイトカラシンB処理によるミクロセル化誘導のための条件(濃度・誘導時間)検討を行い、密度勾配遠心によってミクロセルの回収が行えるかを調べたところ、まだ効率は低いもののミクロセルの回収が行えた。ハイブリッド染色体キャリヤーを誘導するためには、コルセミド/サイトカラシンB処理によるDT-40細胞のミクロセル誘導の前に、VSV-G発現ベクターの導入によってDT-40細胞膜上にVSV-Gを一過的に高発現させる必要があるので、VSV-G遺伝子導入条件やミクロセル化のタイミングの条件を検討した。これまでエレクトロポレーション法では高効率の遺伝子導入が困難であったため、今回はリポフェクション法によるDT-40細胞への遺伝子導入を行ったが、今のところ遺伝子導入効率があまり上がらず、今後も高効率にDT-40細胞へ遺伝子導入できるリポフェクション試薬のスクリーニングを行う必要がある。