小胞体膜電位の光学的測定による細胞内膜系イオンチャネルの機能解析

1.小胞体-核膜にBK型カリウムチャネルが存在し、このチャネルがカルシウムストアからのカルシウム放出を制御することを明らかにした。(1)発生初期鶏胚の網膜神経上皮を単離し、低カルシウム低浸透圧溶液によって個々の細胞を膨化させ、パッチピペットを用いて細胞膜を除去した後、核膜の表面からパッチクランプ記録を行った。その結果、核膜の内腔側の電位を正方向に変化させることにより活性化される単一チャネル電流が記録された。このチャネルの活性化には内腔側のカルシウム濃度を上げる必要があった。これらの電位依存性、及び、カルシウム依存性から、BK型カリウムチャネルの活性化が示唆された。さらに、細胞膜を除去し核膜を露出した標本に、BK型カリウムチャネルに対する抗体を適用し免疫組織染色を行った。その結果、核膜にBK型カリウムチャネルが存在することが示唆された。(2)細胞膜透過性のBK型カリウムチャネル阻害剤であるキニジンを投与すると、カルシウムストアからのカルシウム放出が有意に抑制された。また、BK型カリウムチャネルの選択的阻害剤であるイベリオトキシンを、エレクトロポレーション法によって細胞内へ導入した結果、カルシウムストアからのカルシウム放出が有意に抑制された。2.カルシウムストアの膜電位変化により駆動されるカルシウムオシレーションのモデルの考案。発生初期鶏胚の網膜神経上皮を、膜電位感受性蛍光色素[DiOC_5(3)]で染色し、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡によって小胞体-核膜の膜電位を光学的に測定した。その結果、自発的な膜電位オシレーションが観察された。この膜電位変化の振幅は約45mVに及び、カルシウムストアからのカルシウム放出の駆動力を増減させうると想定された。

1.小胞体-核膜にBK型カリウムチャネルが存在し、このチャネルがカルシウムストアからのカルシウム放出を制御することを明らかにした。(1)発生初期鶏胚の網膜神経上皮を単離し、低カルシウム低浸透圧溶液によって個々の細胞を膨化させ、パッチピペットを用いて細胞膜を除去した後、核膜の表面からパッチクランプ記録を行った。その結果、核膜の内腔側の電位を正方向に変化させることにより活性化される単一チャネル電流が記録された。このチャネルの活性化には内腔側のカルシウム濃度を上げる必要があった。これらの電位依存性、及び、カルシウム依存性から、BK型カリウムチャネルの活性化が示唆された。さらに、細胞膜を除去し核膜を露出した標本に、BK型カリウムチャネルに対する抗体を適用し免疫組織染色を行った。その結果、核膜にBK型カリウムチャネルが存在することが示唆された。(2)細胞膜透過性のBK型カリウムチャネル阻害剤であるキニジンを投与すると、カルシウムストアからのカルシウム放出が有意に抑制された。また、BK型カリウムチャネルの選択的阻害剤であるイベリオトキシンを、エレクトロポレーション法によって細胞内へ導入した結果、カルシウムストアからのカルシウム放出が有意に抑制された。2.カルシウムストアの膜電位変化により駆動されるカルシウムオシレーションのモデルの考案。発生初期鶏胚の網膜神経上皮を、膜電位感受性蛍光色素[DiOC_5(3)]で染色し、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡によって小胞体-核膜の膜電位を光学的に測定した。その結果、自発的な膜電位オシレーションが観察された。この膜電位変化の振幅は約45mVに及び、カルシウムストアからのカルシウム放出の駆動力を増減させうると想定された。