生理的溶液を用いた生殖細胞の高圧ガラス化凍結:究極の凍結保存法を目指して

多様化する実験動物の系等維持法として、動物種を限定しない胚の万能凍結法の開発を目指した高圧ガラス化凍結に関する基礎研究を実施した。電顕試料作成技術として開発された高圧凍結法は、従来のガラス化凍結の問題点である高濃度耐凍剤を用いない瞬間凍結法であり、細胞保存技術としての応用を試みる事とした。実験はマウス胚を対象に、室温から液体窒素温への瞬間高圧凍結過程で発生する物理的な細胞傷害の検出と、その軽減策に焦点を絞った。その結果、耐凍剤を全く添加しない生理的緩衝液を用いて高圧凍結した場合でも、一部の胚はガラス化が達成され細胞内小器官が高度に保存される事が示されたが、それは凍結時の高圧の程度やチャンバー中の資料の位置など偶発的要因に左右され確実性に乏しいことが判った。そこで細胞毒性を示さない程度の濃度の耐凍剤を緩衝液に添加して高圧凍結を試みたところ、断裂や氷晶形成による細胞傷害が殆ど発生せず、高い頻度で細胞内小器官が保存出来ることがわかった。現在、胚を緩慢凍結する際の濃度程度の耐凍剤を添加しており、細胞種によっては毒性を発揮する可能性があるため、今後は耐凍剤の種類や濃度を検討し、より低濃度で細胞傷害性の低い溶液を開発しなければならないが、本研究によって、細胞毒性の低い溶液を用いた高圧凍結法により哺乳動物胚をガラス化凍結出来ることが判った。現時点では融解条件の検討が不十分であり、溶液の脱ガラス化の防止など克服すべき課題は多いが、これらの問題を克服して、細胞毒性の低い凍結溶液を用いた高圧ガラス化凍結が可能となれば、細胞種を限定しない万能凍結保存技術として、その応用範囲は無限大であると考える。

多様化する実験動物の系等維持法として、動物種を限定しない胚の万能凍結法の開発を目指した高圧ガラス化凍結に関する基礎研究を実施した。電顕試料作成技術として開発された高圧凍結法は、従来のガラス化凍結の問題点である高濃度耐凍剤を用いない瞬間凍結法であり、細胞保存技術としての応用を試みる事とした。実験はマウス胚を対象に、室温から液体窒素温への瞬間高圧凍結過程で発生する物理的な細胞傷害の検出と、その軽減策に焦点を絞った。その結果、耐凍剤を全く添加しない生理的緩衝液を用いて高圧凍結した場合でも、一部の胚はガラス化が達成され細胞内小器官が高度に保存される事が示されたが、それは凍結時の高圧の程度やチャンバー中の資料の位置など偶発的要因に左右され確実性に乏しいことが判った。そこで細胞毒性を示さない程度の濃度の耐凍剤を緩衝液に添加して高圧凍結を試みたところ、断裂や氷晶形成による細胞傷害が殆ど発生せず、高い頻度で細胞内小器官が保存出来ることがわかった。現在、胚を緩慢凍結する際の濃度程度の耐凍剤を添加しており、細胞種によっては毒性を発揮する可能性があるため、今後は耐凍剤の種類や濃度を検討し、より低濃度で細胞傷害性の低い溶液を開発しなければならないが、本研究によって、細胞毒性の低い溶液を用いた高圧凍結法により哺乳動物胚をガラス化凍結出来ることが判った。現時点では融解条件の検討が不十分であり、溶液の脱ガラス化の防止など克服すべき課題は多いが、これらの問題を克服して、細胞毒性の低い凍結溶液を用いた高圧ガラス化凍結が可能となれば、細胞種を限定しない万能凍結保存技術として、その応用範囲は無限大であると考える。