生理的溶液を用いた生殖細胞の高圧ガラス化凍結:究極の凍結保存法を目指して

使用生理溶液对生殖细胞进行高压玻璃化冷冻：追求终极冷冻保存方法

• 批准号: 17650121
• 负责人: 越本 知大
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17650121/
• 关键词: 生殖細胞; 凍結保存; ガラス化凍結; 高圧凍結; 透過型電子顕微鏡; 脱ガラス化

多様化する実験動物の系等維持法として、動物種を限定しない胚の万能凍結法の開発を目指した高圧ガラス化凍結に関する基礎研究を実施した。電顕試料作成技術として開発された高圧凍結法は、従来のガラス化凍結の問題点である高濃度耐凍剤を用いない瞬間凍結法であり、細胞保存技術としての応用を試みる事とした。実験はマウス胚を対象に、室温から液体窒素温への瞬間高圧凍結過程で発生する物理的な細胞傷害の検出と、その軽減策に焦点を絞った。その結果、耐凍剤を全く添加しない生理的緩衝液を用いて高圧凍結した場合でも、一部の胚はガラス化が達成され細胞内小器官が高度に保存される事が示されたが、それは凍結時の高圧の程度やチャンバー中の資料の位置など偶発的要因に左右され確実性に乏しいことが判った。そこで細胞毒性を示さない程度の濃度の耐凍剤を緩衝液に添加して高圧凍結を試みたところ、断裂や氷晶形成による細胞傷害が殆ど発生せず、高い頻度で細胞内小器官が保存出来ることがわかった。現在、胚を緩慢凍結する際の濃度程度の耐凍剤を添加しており、細胞種によっては毒性を発揮する可能性があるため、今後は耐凍剤の種類や濃度を検討し、より低濃度で細胞傷害性の低い溶液を開発しなければならないが、本研究によって、細胞毒性の低い溶液を用いた高圧凍結法により哺乳動物胚をガラス化凍結出来ることが判った。現時点では融解条件の検討が不十分であり、溶液の脱ガラス化の防止など克服すべき課題は多いが、これらの問題を克服して、細胞毒性の低い凍結溶液を用いた高圧ガラス化凍結が可能となれば、細胞種を限定しない万能凍結保存技術として、その応用範囲は無限大であると考える。

The basic research on the development of multi-species animal system maintenance method and animal species limitation method was carried out The high pressure freezing method is used to solve the problems of high concentration freezing resistance, instant freezing method and cell preservation technology. In the process of physical cell damage detection and reduction, the temperature of the liquid, the temperature of the liquid and the instantaneous high pressure freezing process are reduced. The results show that the freezing resistance agent is completely added to physiological buffer solution. When freezing at high pressure, some embryos are transformed to achieve high preservation of small organs in cells. The degree of high pressure during freezing, the location of data in the medium, and the main cause of the occurrence are determined. In addition, the concentration of freeze-resistant agent in buffer solution shows the degree of cytotoxicity. In addition, the cell damage caused by high-pressure freezing, fracture and crystal formation is likely to occur, and the intracellular small organs are preserved. In this study, the concentration of freeze-resistant agent at the time of slow freezing, the possibility of cytotoxicity development, the type and concentration of freeze-resistant agent in the future, and the development of low concentration cytotoxic solution were studied. At present, there are many problems to be solved in the analysis of melting conditions, such as the use of high pressure freezing solution with low cytotoxicity, the use of universal freezing preservation technology, and the use of infinite range.

项目成果

Hyperfine structure of vitrified mouse eggs frozen under 2100 bar pressure -Initial report of the attempt at cryopreservation by high pressure freezing

2100巴压力下冷冻玻璃化小鼠卵子的超精细结构-高压冷冻冷冻保存尝试的初步报告

• 发表时间: 2006
• 期刊: Cryobiology 53・3
• 作者: Y.Shichi;C.Koshimoto(他5名)
• 通讯作者: C.Koshimoto(他5名)