GGYGG構造を標的とする新規タンパク質架橋方法の開発

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1、N末端・C末端GGYGGタグベクターを用いた酵素発現と架橋解析pETプラスミドなどの発現ベクターに、ベータグルクロニダーゼ酵素タンパク質(GUS)の遺伝子を組み込み、そのN末端部にGGYGGを3-4回繰り返したポリペプチド(GGYGGタグ)領域を結合させた改良型発現ベクターを構築した。これらのタンパク質を大腸菌で発現・精製後にチロシナーゼを作用させた。その結果、電気泳動後のCBB染色などから、タンパク質が重合し多量体化していることを確認した。GGYGGタグをつけていないGUSでは多量体が観察されなかった。さらに、電気泳動後の活性染色(ザイモグラフィー)によりチロシナーゼが特異的にGGYGGタグ標的として架橋をしたことを確認した。GUSの酵素活性は架橋が進行してもその活性はほとんど変わらないことから、この新規な架橋方法によりタンパク質の酵素活性を阻害することなく、タグだけを架橋することが可能であることが示された。また、N末端部とC末端部でタグを付加した場合に、それぞれの架橋効率には大差はなく、また架橋産物に大きな特性の変化は観察されなかった。2、GGYGGベクターや架橋条件の検討GGYGGの数、チロシナーゼの濃度などを換えて、架橋効率を検討し、架橋に最適な条件設定をおこなった。一方、チロシナーゼ以外に非酵素的な架橋が可能であるかどうかを調べるためにRu錯体、APSなどによる架橋を試みたが、チロシナーゼに比べると架橋効率がはるかに低いことが確認された。