植物Gα-GPCRを介するシグナル化合物及び伝達因子の探索系の開発ならびに探索

出芽酵母(Saccharomyces cervisiae)の性フェロモンシグナル伝達系を利用したシロイヌナズナのGPCRの取得を目指した。FAR1,ScGPA1二重変異株にFus1-nphを導入し、さらにAtGPA1とコントロールとしてScGPA1を導入した。AtGPA1は酵母のGβγを抑えなかった。そこで、ScGPa1とAtGPA1のキメラを製作した。ScGPA1のC末端側5,10,20アミノ酸残基をAtGPA1の配列で置換したchimeraA, chimeraB, chimeraCとAtGPA1のN末端側39アミノ酸残基をScGPA1のN末端43アミノ酸残基で置換したchimeraEを作成し、FAR1、ScGPA1二重変異、Fus1-nphを導入株に導入した。これらのchimera遺伝子を導入した変異株では、Gβγの活性を抑えることが出来た。GPCRのスクリーニングには、より長くAtGPA1の配列を有するchimeraBを用いた。この形質転換酵母にシロイヌナズナcDNAライブラリーを導入し、リガンドとしていくつかの植物ホルモン、または植物からの抽出物を与えた条件で酵母を培養し、幾つかの遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子の解析を進めている。上述の実験に加えて、yeast two-hybrid systemを用いて、AtGPA1結合タンパク質の取得を試みた。野生型AtGPA1と変異を導入したAtGPA1QLを用いた。スクリーニングの結果、ATGPA1QLと相互作用するクローンとしてQL21を得た。QL21はキナーゼ領域を有し、データベース上ではMAPKKKファミリーに属していた。GαとMAPKKKの相互作用は報告例がなく、新たなシグナル伝達様式を構成する可能性を示唆しており、興味深く、その機能の解明を継続中である。

出芽酵母(Saccharomyces cervisiae)の性フェロモンシグナル伝達系を利用したシロイヌナズナのGPCRの取得を目指した。FAR1,ScGPA1二重変異株にFus1-nphを導入し、さらにAtGPA1とコントロールとしてScGPA1を導入した。AtGPA1は酵母のGβγを抑えなかった。そこで、ScGPa1とAtGPA1のキメラを製作した。ScGPA1のC末端側5,10,20アミノ酸残基をAtGPA1の配列で置換したchimeraA, chimeraB, chimeraCとAtGPA1のN末端側39アミノ酸残基をScGPA1のN末端43アミノ酸残基で置換したchimeraEを作成し、FAR1、ScGPA1二重変異、Fus1-nphを導入株に導入した。これらのchimera遺伝子を導入した変異株では、Gβγの活性を抑えることが出来た。GPCRのスクリーニングには、より長くAtGPA1の配列を有するchimeraBを用いた。この形質転換酵母にシロイヌナズナcDNAライブラリーを導入し、リガンドとしていくつかの植物ホルモン、または植物からの抽出物を与えた条件で酵母を培養し、幾つかの遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子の解析を進めている。上述の実験に加えて、yeast two-hybrid systemを用いて、AtGPA1結合タンパク質の取得を試みた。野生型AtGPA1と変異を導入したAtGPA1QLを用いた。スクリーニングの結果、ATGPA1QLと相互作用するクローンとしてQL21を得た。QL21はキナーゼ領域を有し、データベース上ではMAPKKKファミリーに属していた。GαとMAPKKKの相互作用は報告例がなく、新たなシグナル伝達様式を構成する可能性を示唆しており、興味深く、その機能の解明を継続中である。