RNAiを用いた摂食関連遺伝子の機能ターゲッティング法の開発

我々は標的として摂食関連遺伝子に対する配列を発現するプラスミドを構築した。このプラスミドベクターは合成二本鎖RNAそのものと比較して、効果が長時間持続し、投与後のある程度の期間における摂食行動やそれに付随する体重の変動を観察する上では最適であった。具体的にはpRNA-U6.1ベクター(GeneScript)にNPY、NPYY1、Y5受容体に対するターゲット配列を挿入した。この転写産物はU6 RNA polymerase IIIによる転写反応により10塩基のループ形成部位を中間に含み、ステム部位に21塩基ずつのターゲット遺伝子に相補的なセンス配列とアンチセンス配列を有するステムループ状のRNAを細胞内で合成すると考えられた。ターゲット配列の選択はGeneScript社のホームページにあるsiRNA target finderを用いてopen reading frame内でGC%レンジを30-60%の範囲に設定してマウスNPY cDNA配列について検索し、マウスNPY cDNAの77-99bpの領域が最も適切な配列である可能性が示された。同様に、Y1受容体では775-796bp、Y5受容体では867-887bpの配列が示された。そこで、これらの配列を持つoligo DNAを合成してpRNA-U6.1ベクターに挿入した。これらのプラスミドをリポフェクションによって視床下部に導入した。このうち、siRNAによる脳内ニューロペプチドY遺伝子発現抑制の影響をISHとRT-PCR法により、自発摂食量の変化とともに調べた。pRNA-U6.1-NPYベクターを視床下部弓状核に導入するとマウスは3日後で有意に摂食量が減少し(特に夜間での摂食量が減少)、その減少には特異的なNPY mRNAの弓状核での減少が伴っていた。このことはNPY遺伝子発現がマウスの夜間摂食活動の増加に関与することを示していた。

我々は標的として摂食関連遺伝子に対する配列を発現するプラスミドを構築した。このプラスミドベクターは合成二本鎖RNAそのものと比較して、効果が長時間持続し、投与後のある程度の期間における摂食行動やそれに付随する体重の変動を観察する上では最適であった。具体的にはpRNA-U6.1ベクター(GeneScript)にNPY、NPYY1、Y5受容体に対するターゲット配列を挿入した。この転写産物はU6 RNA polymerase IIIによる転写反応により10塩基のループ形成部位を中間に含み、ステム部位に21塩基ずつのターゲット遺伝子に相補的なセンス配列とアンチセンス配列を有するステムループ状のRNAを細胞内で合成すると考えられた。ターゲット配列の選択はGeneScript社のホームページにあるsiRNA target finderを用いてopen reading frame内でGC%レンジを30-60%の範囲に設定してマウスNPY cDNA配列について検索し、マウスNPY cDNAの77-99bpの領域が最も適切な配列である可能性が示された。同様に、Y1受容体では775-796bp、Y5受容体では867-887bpの配列が示された。そこで、これらの配列を持つoligo DNAを合成してpRNA-U6.1ベクターに挿入した。これらのプラスミドをリポフェクションによって視床下部に導入した。このうち、siRNAによる脳内ニューロペプチドY遺伝子発現抑制の影響をISHとRT-PCR法により、自発摂食量の変化とともに調べた。pRNA-U6.1-NPYベクターを視床下部弓状核に導入するとマウスは3日後で有意に摂食量が減少し(特に夜間での摂食量が減少)、その減少には特異的なNPY mRNAの弓状核での減少が伴っていた。このことはNPY遺伝子発現がマウスの夜間摂食活動の増加に関与することを示していた。