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有機溶媒耐性及び高温耐性シトクロムP450の精製と医薬品合成及び異物代謝への応用

耐有机溶剂、耐高温细胞色素P450的纯化及其在药物合成和外源代谢中的应用

基本信息

批准号：
18659045
负责人：
今岡進
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

好熱菌由来のチトクロームP450(P450)の三次構造安定性を利用して、有機溶媒中で有機物質を代謝できる酵素系の構築を目的とし、この反応系を医薬品合成や環境中のダイオキシンやPCBなどの異物分解に応用することを目標とする。まず、好熱菌Thermus thermophzlus由来のP450であるCYP175AlcDNAを単離し大腸菌で発現させ、これがβ-カロテンを代謝することを明らかにした。さらに、平成19年度においては、未知であったP450電子伝達系の精製・単離を試みた。Thermtus thermophilusの細胞質画分をイオン交換クロマトグラフィーにより大きく6つの画分(A〜F)に分画し、それぞれの画分とCYP175A1、NADPHを混合し、β-カロテンへの水酸化活性を測定したところ、画分Cと画分EとCYP175A1、NADPHを混合した時にのみ水酸化活性が検出された。このため、画分Cと画分Eをそれぞれアフィニティークロマトグラフィー(ADP-Sepharose)や疎水性クロマトグラフィー(butyl-Sepharose)などを用いてさらに分画し、どの画分に電子伝達系が存在しているかを確認するため、前記と同様にそれぞれの画分とCYP175A1、NADPHを混合しβ-カロテンへの水酸化活性を測定した。これらの因子が単一バンドにまで精製されたところで、MALDI-TOF/MSを用いて、そのバンドに含まれるタンパク質を同定したところ、画分Cに含まれるタンパク質はthioredoxin reductase、画分Eに含まれる電子伝達タンパク質はferredoxinであることが明らかとなった。この結果から、CYP175A1の電子伝達系はNADPHを電子供与体として、thioredoxin reductase及びferredoxinから構成されていることが明らかとなった。さらに、これらを大腸菌に発現させ精製して、熱安定性を確認した。

The third order structural stability of P450(P450) is used for the purpose of enzyme system construction, metabolism of organic substances in organic solvents, synthesis of medical products and decomposition of foreign substances in the environment. The CYP175Al cDNA from Thermus thermophzlus was isolated from Escherichia coli and metabolized by β-glucagon. P450 electronic transmission system is refined and isolated. Thermus thermophilus cytosolic fraction (A ~ F) is separated, separated and CYP175A1, NADPH is mixed, β-glucagon hydration activity is measured, separated C ~ E ~ CYP175A1, NADPH is mixed, and hydration activity is measured. The presence of an electron transfer system was confirmed by the determination of the hydrolysis activity of CYP175A1 and NADPH in the presence of an electron transfer system in the presence of ADP-Sepharose and butyl-Sepharose. The factors include the following: MALDI-TOF/MS, MA The results showed that CYP175A1 electron transfer system was composed of NADPH electron donor, thioredoxin reductase and ferredoxin. In addition, these products were found to be refined and their thermal stability was confirmed.

项目成果

期刊论文数量（8）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

CYP175A1の酸素学的解析

CYP175A1 的氧分析

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
Nakagawa H;et al.;Niwa T.;Takemura S.;Y.Minamiyama et al.;S.Imaoka et al.;T.Hiroi et al.;T.Hiromoto et al.;T.Hiromoto et al.;萬代敬生
通讯作者：
萬代敬生

Cytochrome P450 is responsible for nitric oxide generation from NO-aspirin and other organic nitrates.