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網羅的16SrDNA多型性解析による潰瘍性大腸炎原因菌の同定:病変局所からの検索

通过综合 16S rDNA 多态性分析鉴定溃疡性结肠炎致病菌：从病变定位搜索

基本信息

批准号：
18659102
负责人：
岡安勲
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659102/
关键词：
潰瘍性大腸炎腸内細菌 16SrRNA遺伝子 16SrDNA Fusobacterium varium

项目摘要

潰瘍性大腸炎(UC)は原因不明であるが、発症には腸内細菌が関与していると考えられる。我々は患者大腸粘膜の培養法からFusobacterium varium(F.varium)がUCの発症に関わることや、UC患者にF.variumを対象とした抗生剤によって大腸炎が有意に改善することを示した。しかし、UCの発症原因としては複数の腸内細菌が関与していると考えられるため、細菌の16SrRNA遺伝子多型性を利用した、UC大腸粘膜局所における細菌の同定方法を確立し、UC発症に関わる腸内細菌の同定を目指した。方法として、1.OCT compound包埋UC患者大腸粘膜凍結切片を用い、以下の手順による同定方法を検討し、確立した:(1)laser-captured microdissectionによる病変局所の採取とDNA抽出,(2)16SrDNAのPCR,(3)plasmid vectorへのクローニング、(4)半定量を行うための多数クローンの採取、(5)plasmidクローンのsequencing,(6)細菌データベースを用いた同定。2.さらに本方法を使ってUC患者大腸粘膜生検資料の陰か炎、大腸内腔側粘膜などから選択的に試料を得て、局在する細菌の同定を行った。結果として、(1)UC患者大腸粘膜の未固定凍結切片の病変部からmicrodissection法にて、正確に病変部を採取して、16SrDNAの上流域でPCRをかけ、DNA抽出kit及びPCR条件を検討して、非特異的細菌DNAは検出されずにかつ高いPCR感度を得ることができた。(2)連続凍結切かぶら陰か上皮を採取することによって、PCRで検出可能な細菌量を得て、細菌の同定かできた。(3)本方法によって3名のUC患者大腸生検組織からの細菌の同定を行い、多種類の場内細菌を同定し、そのクラスタリングを行った。以上より、微量のUC患者大腸粘膜病変からの網羅的な細菌探索・同定系を確立することができた。本方法を使って少数例の病変部に局在する細菌の同定を行い、大腸炎発症に関与する可能性のある候補菌を同定した。

Ulcerative colitis (UC) is caused by bacteria in the intestine. The culture method of the large intestine mucosa of the patient shows that the F.varium is related to the development of UC, and the F.varium is related to the development of colitis. The identification of intestinal bacteria associated with UC development is indicated by the identification of intestinal bacteria associated with UC development using 16S rRNA gene polymorphism. Methods: 1. OCT compound was used to embed frozen sections of colon mucosa from UC patients. The following methods were investigated and established:(1)laser-captured microdissection, DNA extraction,(2) PCR of 16S rDNA,(3)plasmid vector,(4) semi-quantitative analysis,(5)plasmid sequencing,(6) bacterial sequencing. 2. This method enables the identification of bacteria in the colon mucosa of UC patients, including vaginal inflammation, intestinal mucosa, and local bacteria. Results: (1) The microdissection method was used to detect the pathological part of unfixed frozen sections of colorectal mucosa from UC patients, the correct pathological part was detected, the upper part of 16S rDNA was detected by PCR, DNA extraction kit and PCR conditions were investigated, and the non-specific bacterial DNA was detected by PCR sensitivity. (2)The number of bacteria detected by PCR was determined by DNA sequencing. (3)The method was used to identify the bacteria in the large intestine tissues of 3 UC patients, to identify the bacteria in various fields, and to identify the bacteria in various fields. The above mentioned bacteria are explored and identified in the colon mucosa of UC patients. The method enables the identification of bacteria in a small number of disease areas, and the identification of candidate bacteria related to colitis development.