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マーカー酵素の免疫学的比活性を用いた野生魚類への殺虫剤曝露の高感度・高精度検出法

利用标记酶免疫比活的高灵敏度、准确检测野生鱼农药暴露的方法

基本信息

批准号：
19651031
负责人：
解良芳夫
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

新たなバイオモニタリング技術として、国内の河川・湖沼などの野外調査によく用いられるコイのアセチルコリンエステラーゼ(Acetylcholinesterase)をマーカー酵素として、その「免疫学的比活性」を用いて、有機リン系殺虫剤による曝露の有無を高感度・高精度で検出する技術の開発を行うことが本研究の目的である。平成20年度は、以下の研究実績をあげた。1.酵母細胞を用いたコイのアセチルコリンエステラーゼ分泌生産と発現産物の特徴解析酵母Pichia pastorisに分泌生産させたコイのアセチルコリンエステラーゼ"遺伝子組換え触媒サブユニット"を培養液から単離・精製し、特徴解析を行った。組換え酵素はN結合型糖鎖付加を受けていただけではなく、その一部がプロテアーゼによる切断を受けていることが示された。組換えコイアセチルコリンエステラーゼは,高い基質濃度範囲で基質阻害を受けることや至適pH、至適温度、基質特異性と阻害剤(殺虫剤を含む)に対する感受性などは,天然本酵素とほぼ同じであったが、各基質に対するキネティックパラメーターは大きく異なっていることが明らかとなった。2.大腸菌を用いたコイのアセチルコリンエステラーゼ生産と抗体作成大腸菌を用いて,コイのアセチルコリンエステラーゼ"遺伝子組換え触媒サブユニット"を生産した。組換え酵素は多量に発現したが封入体を形成した。そこで、封入体から組換え酵素を単離・精製し、それを抗原として、ウサギに免疫して抗体を作製した。得られた抗体は大腸菌で生産させた組換えコイアセチルコリンエステラーゼだけではなく,天然コイ本酵素と,酵母で生産させた組換えコイ本酵素も認識し,アセチルコリンエステラーゼの免疫学的検出に使用可能であることが示された。

The purpose of this study is to develop a new technology for detecting the presence or absence of high sensitivity and high precision of organic pesticide in field investigation of rivers and lakes in China. Heisei 20 years, the following research achievements. 1. Yeast cell secretion production and product characterization Yeast Pichia pastoris secretion production and product characterization Yeast Pichia pastoris secretion production A part of N-linked glycogen binding enzyme is isolated from N-linked glycogen. The composition of the enzyme is different from that of the natural enzyme, and the substrate concentration range is different from that of the natural enzyme, and the substrate resistance is affected by the optimum pH, the optimum temperature, the substrate specificity and the resistance agent (insecticide). 2. Coliform bacteria are used in the production of antibodies. Coliform bacteria are used in the production of antibodies. A lot of enzymes are present in the form of capsules. In addition, the enzyme is purified and purified, and the antigen is purified and purified. It is possible to detect the use of antibodies in E. coli production, natural enzyme production, yeast production, and immunology.

项目成果

期刊论文数量（11）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Expression of recombinant carp acetylcholinesterase in Escherichia coli and its purification.

重组鲤鱼乙酰胆碱酯酶在大肠杆菌中的表达及纯化。

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
0
作者：
Koichi Yokota;Ryohei Sato;Katsumasa Abe;Shouji Takahashi;Yoshio Kera
通讯作者：
Yoshio Kera

Production of recombinant carp acetylcholinesterase by Escherichia coli and its purification.

大肠杆菌生产重组鲤鱼乙酰胆碱酯酶及其纯化。

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
Ryohei Sato;Kouichi Yokota;Katsumasa Abe;Shouji Takahasi;Yoshio Kera
通讯作者：
Yoshio Kera

Cloning and expression of carp acetylcholinesterase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme

DOI：
10.1016/j.pep.2008.12.003
发表时间：
2009-04-01
期刊：
PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION
影响因子：
1.6
作者：
Sato, Ryohei;Matsumoto, Toru;Kera, Yoshio
通讯作者：
Kera, Yoshio

コイアセチルコリンエステラーゼの酵母Pichia pastorisにおける発現

辅乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中的表达

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
Ryohei Sato;Yasyko Imai;Norio Hidaka;Shouji Takahasi;Yoshio Kera;日高規雄・松本徹・佐藤了平・今井やす子・高橋祥司・解良芳夫・山田良平
通讯作者：
日高規雄・松本徹・佐藤了平・今井やす子・高橋祥司・解良芳夫・山田良平

コイ由来アセチルコリンエステラーゼの大腸菌による生産と精製の検討.

使用大肠杆菌生产和纯化鲤鱼来源的乙酰胆碱酯酶的研究。