新規鎖状ポリエン抗生物質エナシロキシンの生合成に関与する酸化酵素に関する研究

新型线性多烯抗生素烯酰氧生物合成中氧化酶的研究

• 批准号: 05660079
• 负责人: 伊崎 和夫
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05660079/
• 关键词: エナシロキシン; エナシロキシン酸化酵素; Frateuria; ピロロキノリンキノン; エナシロキシン酸化酵素補酵素

エナシロキシンIIa生合成の中間体と思われるエナシロキシンIVaを酸化して、エナシロキシンIIaとするエナシロキシン酸化酵素が生産菌の培養上清に見いだされ、この酸化酵素の精製を試みた。アカパンカビNeurospora crassa IFO 6068株をCzapek-Dox培地で培養し、その培養上清にFrateuria W315株を30℃30時間培養した。その遠心上清を粗酵素液とし、限外ろ過、超遠心、硫安塩析、Butyl-Toyopearl 650M,Hydroxylapatite等を用いて精製した。その結果SDS-PAGEにおいて単一なバンドとなる標品が得られ、非活性は170倍に上昇した。SDS-PAGEとゲルろ過(FPLC)により、分子量はそれぞれ約73kDa、約79kDaと推定され、本酵素はモノマーであることが示唆された。また至適温度は60℃、至適pHは9.0、等電点は6.2であった。基質としてはエナシロキシンIVaおよびIIIa以外は全く反応せず、特異性が非常に高かった。本酵素はMg^<2+>、Ca^<2+>を要求し、二価の重金属イオンやカルボニル試薬により阻害され、キレート剤、SH試薬そしてKCNやNaN_3等により殆ど影響を受けなかった。また本酵素から補酵素を取り除いたアポ型の酵素にピロロキノリンキノン(PQQ)とMg^<2+>を添加したところ活性が回復した。しかし本酵素から単離した補酵素画分のスペクトル解析によりPQQと異なる吸収ピークが検出され、また薄層クロマトグラフィでもRF値が異なるので、PQQ類縁ではあるが新しい補酵素である可能性が示唆された。

The intermediate for the synthesis of the enzyme is acidified and purified by the culture supernatant of the production bacteria. Neurospora crassa IFO 6068 strain was cultured in Czapek-Dox culture medium, and Frateuria W315 strain was cultured at 30℃ for 30 minutes. Purified by using crude enzyme solution, limited enzyme solution, ultra-remote enzyme solution, sulfur analysis, Butyl-Toyopearl 650M, Hydroxylaptite, etc. SDS-PAGE results showed that the activity of the standard was increased by 170-fold. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of the enzyme was about 73kDa. The optimum temperature is 60℃, the optimum pH is 9.0, and the isoelectric point is 6.2. The matrix is very high in specificity except for the matrix. The enzyme is influenced by Mg^<2+>, Ca^<2+>, heavy metal ions, heavy metal ions, heavy metal ions The enzyme is removed and the enzyme is removed. This enzyme is isolated from the enzyme and analyzed in different ways. It is possible to detect RF in different ways. It is possible to detect PQQ in different ways.

项目成果

T.Watanbe,T.Sugiyama,K.Izaki: "New polyenic antibiotics active against Gram-positive and Gram-negative bacteria IX.Reclassification of a strain producing enacyloxin" J.Antibiotcis. 47 No.4. 413-415 (1994)

T.Watanbe、T.Sugiyama、K.Izaki：“对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有活性的新型多烯抗生素 IX。产生烯酰霉素的菌株的重新分类”J.Antibiotcis。