家畜におけるエンドトキシンショック時の血中No代謝物の測定法の確立とその臨床方法

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基礎的実験として、単離マクロファージを用いて、各種サイトカインを用いた刺激により発生するNOの細胞毒性や細胞分化における役割を解析した。実験に用いたClostridium botulium exoenzyme C3(C3)はsG蛋白質(Small molecular weight GTP-binding proteins)のひとつであるRhoをADP-リボシル化することによって、不活化することが知られている。このC3がインターフェロンガンマによるNOの生成に関与するかどうかを観察した結果、Rhoがインターフエロンガンマによって誘発される、iNOSの遺伝子発現に関わっていることがあきらかとなった。これらの系におけるNOの検出系としては、NOの代謝物であるところのNO^<2->+NO^<3->の定量測定法として、グリース反応が用いられているが、この方法は、感度が低く、実際に血清中のNOを測定することは困難であると思われる。我々は、グリース反応よりも、検出感度が高いと報告されている2,3-ジアミノナフタレン(DAN)を用いての、蛍光光度法によるNOの検出と、N-メチル-D-グルカミンジチオカルバメート鉄錯体を用いたESR-スピントラッピング法を比較検討した。DANによるNOの検出限界は、ほぼ、グリース反応の50倍、スピントラッピング法では、10倍の検出感度が得られた。また、実際のニトロシルチオールの特異抗体の作成については、抗原として、内因性の物質として牛血清アルブミン、さらにはほ乳動物体内には存在しないヘモシアニンを用いそれぞれ、NO飽和水に溶解してニトロ化を行った。現在、これらの物質を用いて兎に免疫し、ニトロ化タンパク質の特異抗体の精製をおこなっており、今後ニトロ化タンパク特異抗体を用いて、感染を受けた家畜の血清中のニトロ化タンパク質の定量をおこなっていきたい。