C型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムの複製酵素RNAポリメラーゼの解析

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NS5B遺伝子産物の可溶化が困難なことから、当初予定した遺伝子産物の解析は据え置き、次の三点の研究を行い以下の結果を得た。1.NS5Bによる複製開始点と考えられるHCVゲノムの3′端の構造を明らかにした。血清中のHCV-RNAの3′端にRNAリンカーを結合させたのち、リンカー部位からcDNAを合成し、リンカーとHCVのコーディング領域をPCR法で増幅して3′端領域を得て解析したところ、1)HCVの3′端は、ポリUにつづいて3′側にCUUリピート(あわせて約100b)、それに保存性の高いコアエレメント領域(100b)からなっていた。2)1b型には、U-OHとUUU-OHの異なる3′端が見られた。3)コアエレメント領域は3つのヘアピン構造からなる高次構造があるが、異なる遺伝子型間で見られる2-5塩基の違いは、いずれも3つのヘアピン構造を維持する塩基置換であった。4)現在、全HCV-RNA(約10kb)を試験管内で合成し、培養細胞へのトランスフェクション実験を行っているが、これまでのところ増殖するウイルスは得られていない。2.INF抵抗性株と感受性株を簡単に見分ける方法を確立した。INF抵抗性に関連するNS5A領域(2209-2248)のみをSSCP法により分析したところ、INF抵抗性株型の一本鎖DNAは全て移動度が速く、感受性のそれは遅く、抵抗性株と非抵抗性株をSSCPの移動度のみでほぼ決定できることが明らかになった。3.準変異株ごとにHCV全ゲノムをクローニングする技術を確立した。INF抵抗性決定領域を知る目的で、INF感受性株、抵抗性株HCVゲノムのcDNAを数百塩基重複した3つの断片に分けて増幅、クローニングした。それぞれの断片は、重複部分のSSCP移動度ごとに分類し、同一の移動度のものどうしを順にT7プロモータの下流に入れ、HCV-RNA合成ができるようにした。