3次元蛍光共鳴エネルギー移動法による細胞内タンパク質間相互作用の解析

利用三维荧光共振能量转移法分析细胞内蛋白质-蛋白质相互作用

• 批准号: 14658229
• 负责人: 武藤 吉徳
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658229/
• 关键词: FRET; 蛍光共鳴エネルギー移動; 3次元立体像; 遺伝子導入; NP25; GFP; 蛍光顕微鏡

神経系組織で高度な発現が認められる新規タンパク質であるNP25について,3D-FRETシステムを用いて蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の解析を行った。本タンパク質は,筋肉系組織に特異的に存在するCalponinやSM22等のタンパク質に対して著しく高いアミノ酸配列の相同性を示すことから,これらのタンパク質と類似の機能が予想された。CalponinやSM22については既に多くの報告がなされており,アクチンとの相互作用が明らかにされている。そこで,NP25とアクチンの結合について検討した。FRET測定にはNP25の蛍光免疫染色によるImmuno-FRET法を新たに導入し,donorとしてAlexa488,acceptorとしてRhodamineを使用した。またFRET効率の推定には,acceptor photobleaching法を用いた。Neuroblastoma cell lineであるSK-N-SH細胞をNP25抗体+Alexa 488二次抗体で染色後,アクチンは,rhodamine-phalloidinで染色した。この細胞について,acceptor photobleachingによるImmuno-FRET法を適用すると,アクチンとNP25の結合を示す高いFRET効率が細胞内のストレスファイバー上で検出された。このことは,NP25が細胞内で実際にアクチン繊維と結合していることを示している。また,PC-12細胞を用いた観察から,NGFによって誘導される神経突起の形成に伴いNP25の発現量が増加することが明らかとなった。これらの結果は,神経突起の伸長に必須名アクチン繊維の構築にNP25が関与していることを示唆する。

The organization of the nervous system is highly developed and the analysis of optical resonance shift (FRET) is carried out using the new NP25 system. This paper describes the characteristics of the muscle tissue, such as Calponin and SM22, and their similar functions. Calponin SM22 is a very interesting place to be. NP25 is a combination of NP25 and NP 25. FRET assay is a new method of immunostaining for NP25, donor Alexa488,acceptor Rhodamine. In addition, the acceptor photoleaching method is used to estimate the FRET efficiency. Neuroblastoma cell line is stained with NP25 antibody +Alexa 488 secondary antibody,rhodamine-phalloidin staining. The immuno-FRET method is suitable for cell culture,acceptor photoleaching, and binding of NP25 shows high FRET efficiency. NP25 is an intracellular protein that binds to cells. In PC-12 cells,NGF was induced to form neurite and NP25 production increased. As a result, the elongation of the nervous system must be determined by the relationship between NP25 and NP25.

项目成果

Kato, M. et al.: "Effects of Bacteroides Phosphoshingolipids on Murine Neutrophils"Anaerobe. 8(1). 23-28 (2002)

Kato, M. 等人：“拟杆菌磷鞘脂对鼠中性粒细胞的影响”厌氧菌。

Mori, K.et al.: "Neuronal protein NP25 interacts with F-actin."Neuroscience Research. 印刷中. (2004)

Mori, K. 等人：“神经元蛋白 NP25 与 F-肌动蛋白相互作用。”神经科学研究出版（2004 年）。

Muto, Y. et al.: "Inhibition of mitochondrial respiration by climacostol"Jpn.J.Protozool.. 36(1). 25-26 (2003)

Muto, Y. 等人：“climacostol 对线粒体呼吸的抑制”Jpn.J.Protozool.. 36(1)。

Takano, Y.et al.: "The RING-Finger Protein, RNF8, Interacts with Retinoid X Receptor α and Enhances its Transcription-Stimulating Activity"The Journal of Biological Chemistry. 印刷中. (2004)

Takano, Y. 等人：“RING-Finger 蛋白，RNF8，与类视黄醇 X 受体 α 相互作用并增强其转录刺激活性”，《生物化学杂志》出版（2004 年）。

Mori, K.et al.: "Neuronal protein NP25 increases during neural differentiation."岐阜大学医学部紀要. 印刷中. (2004)

Mori, K. 等人：“神经分化期间神经元蛋白 NP25 增加。” 岐阜大学医学院通报 (2004)。