パッチクランプ法による植物細胞の電気融合に関する基礎研究

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試料にはサラダ菜葉肉およびピーマン果肉を用い、そのプロトプラスト化(裸細胞)とガラス電極の作成の技術は確立できた。電極にパッチクランプされた細胞内外の電気的絶縁機密(ギガ・オーム抵抗)の技術は確立できなかった。そのため細胞膜に通電した電流の漏電による雑音電流が大きく、細胞膜のイオンチャンネル電流値は得られず、実験は継続中である。それと並行して高周波交流電圧印加とパルス電圧印加による一対の同種および異種細胞間の融合特性および融合速度を調べた。実験はPH=5.5、マン=トール10wt%、塩化カルシュウム0.1mM溶液中で、それらの融合過程を顕微鏡下のビデオ撮影で追跡し、以下の結果をえた。融合特性:電圧印加時間を一定にして、パルス印加電圧およびパルス巾が融合におよぼす効果を調べた。1)印加電圧とパルス巾により融合不能領域、融合領域、細胞破壊領域が存在し、そのマップを得た。融合の下限印加電圧は、パルス巾が短い領域では高電圧が必要で、パルス巾が長くなるほど低電圧となり、これは細胞種によらず共通の傾向であった。しかし、上限印加電圧とパルス巾の関係は細胞種により異なった。2)融合初期に離脱した細胞間では再融合しない領域が存在した。融合速度:融合の初期速度から速度定数を定義し、細胞性状および操作条件が速度定数におよぼす影響を調べた。1)一対の細胞間で細胞径に差異がある場合の方が融合速度は速い。2)細胞径の小さいもの同士の方が融合速度は速い。3)速度定数におよぼす環境温度の影響は大きい。融合の活性化エネルギーは約120kJ/molであった。融合の際の細胞膜の可動性と大いに関係する。4)融合速度はプロトプラスト作成後の経過時間によって影響され、作成後2時間以内の試料が最も良好な再現性を示した。また、融合速度は細胞年令によっても影響され、細胞年令の若いものほど速い。