ブタ胚性幹細胞の樹立ならびに幹細胞受容胚としての体外受精卵の利用可能性の検討

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ブタ胚性幹(ES)細胞の樹立を最終目的とし、それに関する基礎研究を行った。(1)ブタ胚由来細胞の特性とES細胞樹立法:6.5〜10.5日齢の胚盤胞を使用した。フィーダーにはマウス胎児繊維芽細胞のSL10細胞を使用した。胚由来細胞の培養には、LIF+(10^4U/ml)あるいはLIF-の、非必須アミノ酸等を添加した20%FCSを含む、DMEMを用いた。拡張胚盤胞以降の胚は、栄養外胚葉が24時間以内に黒変死滅した。透明帯除去胚を、免疫手術,切断分離、または全胚で培養した結果、胚細胞はフィーダー層に付着し、胚由来細胞のコロニーを形成した。付着性,コロニー形成能とも全胚培養が良かった。胚葉体状,上皮状等の分化細胞コロニーが多く出現した。マウスES細胞様のコロニーも出現したが、培養日数とともに上記分化細胞のコロニーを形成し、継代とともに分化細胞が増加し、最終的に分化細胞のみになった。分化細胞は最高7世代、40日以上体外で生存したが、分化抑制はできなかった。免疫手術は内細胞塊の生存性や増殖性を低下させた。マウスLIFのブタES細胞の分化抑制効果はなかった。(2)体外受精法における単精子受精条件:卵母細胞の成熟培養後の媒精(1.0〜1.5×10^4精子/ml)までの時間と媒精時間について検討した。多精子受精率は成熟時間に関係なく高く、また媒精時間6時間以内では精子侵入卵が得られず、12時間では多精子受精率が80%近かった。9時間の媒精時間では、精子侵入率が70%と12時間区より低かったが、単精子受精率は50%にまで上昇した。(3)単為発生卵の体外分割能:電気刺激法により体外成熟卵母細胞を活性化した。活性化卵の核型は2極体1核型の半数体が大半を占め、電気刺激の10分後には1/3の卵母細胞の染色体は後期像を示していた。4時間後には核が形成され、電気刺激直後から卵子は活性化されることが明らかになった。これらの卵子の60〜80%は培養44時間後に分割し、その約2/3は4細胞期に達していた。