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ウシ副腎皮質細胞における新規calmodulin結合タンパク質の構造と機能の解明

阐明牛肾上腺皮质细胞中新型钙调蛋白结合蛋白的结构和功能

基本信息

批准号：
05807008
负责人：
見尾光庸
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

【目的】ウシ副腎皮質細胞を、substance Pによって刺激した際に、cortisol分泌に先行して特異的に発現する分子量240kDaの新規なcalmodulin結合タンパク質の構造と機能を明らかにする目的で、このタンパク質の精製とcDNAライブラリーの作成を行なった。【実験方法】初代培養ウシ副腎皮質細胞にsubstance P(10^<-8>M)を37℃にて30分間作用させた後、テフロンホモジナイザーにてhomogenizeし、2,000xg,4℃,5分間の遠心により、未破壊細胞と核とを除去した。この上清を100,000xg,4℃,30分間超遠心を行ない,得られた上清を細胞質分画とした。これを、Sephadex G-200 column chromatographyによってゲル濾過し、分子量240kDa付近のfractionを回収した。限外濾過による濃縮を行なった後、calmodulin-Sepharoseを用いたaffinity chromatographyを行ない、目的の分子量を持ったcalmodulin結合タンパク質を回収した。一方、ウシ副腎皮質細胞のcDNA libraryを作成するために、ウシ副腎皮質細胞からguanine-hot phenol法によりtotal RNAを抽出し、oligo-dT columnを用いてpoly A-RNAの精製を行なった。このpoly A-RNAをreverse transcriptaseによりcDNAとし、λgt10phageにin vitro packagingを行なった。【結果・考察】Sephadex G-200 column及びcalmodulin-Sepharose affinity columnだけでは、目的とするタンパク質の純度を60%以上にすることはできなかった。現在、イオン交換カラムによる精製条件を検討中である。一方、このタンパク質を副腎皮質細胞のcell hogomenateに添加したところ、5μg/ml以上の濃度でCa^<2+>及びcalmodulin依存性にcortisol合成を惹起した。現在の段階では、Edman分解によるアミノ酸配列の決定を行なうにはタンパク質の純度・量ともに不足しているため、更に精製操作を繰り返している。一方、ウシ副腎皮質細胞のcDNA libraryの作成は完了しているが、これは、resting cellのlibraryであるため、substance P刺激下に誘導されるmRNAのcDNAが十分に含まれていない可能性もある。そこで、substance Pを作用させた副腎皮質細胞からmRNAを抽出して電気泳動で分離後、目的とするタンパク質合成を開始させるmRNAを含む分画を回収し、これを用いたdifferential hybridizationや発現クローニングが行なえるよう、mRNAの精製と分画を行なっているところである。

[objective] to detect the molecular weight of 240kDa, the molecular weight of 240kDa, the new regulation of calmodulin, and the secretion of cortisol. [objective] to detect the molecular weight, molecular weight and molecular weight. [methods] after the primary culture cell substance P (10 ^ & lt;-8>M) was incubated at 37 ℃ for 30 minutes, the cells were incubated at 37 ℃ for 30 minutes, then the temperature was 4 ℃, the temperature was 2000xg, the temperature was 4 ℃, and the core of the unbroken cell was removed. After the supernatant of 100000xgcine at 4 ℃ for 30 minutes, the supernatant of the supernatant was drawn separately. The molecular weight of Sephadex GMel was 200 column chromatography, and the molecular weight 240kDa was close to that of fraction. After the operation, the calmodulin-Sepharose uses the affinity chromatography to determine the molecular weight of the product. The molecular weight of the product is determined by the combination of the calmodulin and the molecular weight. One side, the accessory skin, the cell, the cDNA library, the cell, the cell, the guanine-hot phenol, the total RNA, the oligo-dT column, the poly A-RNA, the cell, the cell, the cell, "poly A-RNA" reverse transcriptase "cDNA", "λ gt10phage" in vitro packaging "line". [results] the results showed that the temperature of Sephadex Glycol 200column and calmodulin-Sepharose affinity column was more than 60%, and the target was very low. At present, we are in contact with each other. We are in the middle of a series of conditions. On the other hand, the synthesis of calmodulin-dependent cortisol is caused by the addition of cell hogomenate, a temperature of more than 5 μ g