プロテインAゴールド・シルバ-染色法による電顕免疫二重染色法の開発

点击翻译按钮获取中文摘要

電顕免疫二重プロテインAゴールド・シルバ-(PAGS)染色法の開発に先立ち、通常の光顕PAGS染色法に影響を及ぼす種々の条件について検討を加えた。これを基に光顕免疫二重PAGS染色法をさらに改良したone-step現像による二重PAGS染色法(光顕)を考案し(投稿準備中)、これらの成果に基づいて電顕免疫二重PAGS先駆法の開発に取り組んだ。対象抗原としては、インスリンおよびグルカゴンの2種のペプタイドを選択し、必要に応じて他のペプタイドも対象とした。電顕免疫二重染色法では、同一切片上で検出する複数の抗原に対して適当な固定剤や包埋用樹脂を選択する必要があるので、PAG法およびPAGS法に敵する固定液の種類と包埋用樹脂の検討を行い、その結果抗原がペプタイドの場合、抗原検出性の差異は、使用した固定剤の種類の違いによるよりも、包埋用樹脂の種類の違いによる差異の方が大きいことがわかった。すなわち、免疫細胞化学には比較的不適当と考えられていたEpon樹脂包埋法にエッチングを併用する方法が、LR-Whiteなどの新しい包埋用樹脂を用いるよりも、PAG法によって比較的幅広く多種類の抗原を検出できた。これらの基礎的データを基に、同一金粒子サイズのPAGを用いて第一抗原をPAGS染色法で、第二抗原をPAG染色法で検出する二重染色を試みた。その結果、第一染色の陽性部位には現像による金属銀の沈着が、また第二染色の陽性部位には金属銀の沈着のない金粒子の局在が観察された。しかしながら二種の反応産物の識別性、非特異的銀粒子の沈着の予防とこれに深く関わると思われるメッシュの選択の処理、最適金粒子サイズの決定、最適現像時間の検討など未だ解決しなくてはならない問題も多く残されているので、更に研究を継続し、最終的には電顕細胞学において最も一般的なglutaraldehydeosmium固定・Epon包埋による超薄切片で電顕免疫二重PAGS染色法を可能にしたいと考えている。