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Porphyromonas gingivalisプロテアーゼの活性中心構造の解析

牙龈卟啉单胞菌蛋白酶活性中心结构分析

基本信息

批准号：
07672007
负责人：
西方真
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisの産生する44kDaアルギニン特異的プロテアーゼ(赤血球凝集性)と50kDaリジン特異的プロテアーゼの活性中心のアミノ酸配列を決定することであった。研究方法と結果は次のとおりである。アルギニン特異的プロテアーゼの場合プロテアーゼを精製後、これを[^3H]アセチルリジンクロロメチルケトン(ALCK)で処理し、活性部位をラベルした。この様にラベルしたプロテアーゼをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、PVDF膜に電気的に転写した。放射能を有するバンドを切り取り、エンドプロテイナーゼAsp-Nで消化した。膜から遊離したペプチドを高速液クロにより分離し、放射能を有するピーク(1本のみ検出された)を単離した。このペプチドを水素化ホウ素ナトリウムで処理した後(クロロメチルケトンのケトン基を還元するため)、高速液クロで精製した。得られたペプチドを、そのままアミノ酸配列分析にかけたところ、Asp-Val-Ala-X-Val-Asn-GLyと決定された。Xは特定のアミノ酸とは同定されなかったが、配列分析機のチャート上には未知の放射性ピークが検出された。このピークは、本プロテアーゼの性質より、ALCKと反応したシステイン残基由来のものと推定される。このことを証明するためにソマトスタチン(3及14番目のアミノ酸がCys)をモデルペプチドとして選び、ALCKと反応させた後、上述の様に還元し配列分析を行った(4サイクル目まで)。その結果、3番目のサイクルに上述の未知のピークが検出された。この様に、XはCysと決定され、全配列はAsp-Val-Ala-Cys-Val-Asn-Glyと決定された。この配列は、Clostridium histolyticum由来のプロテアーゼであるクロストリパインの活性部位配列Asp-Ala-Cys-Leu-Met-Glyによく似ていた。リジン特異的プロテアーゼの場合上記と全く同様に実験を行おうとし、膜から遊離させたペプチドを高速液クロにより単離しようとしたが、放射能が非常に幅広いピークとして検出された。このピークを単離して配列分析を行ったが、アミノ酸としては同定されなかった。理由は分からないが、アミノ酸配列上の問題かもしれない。不本意ながら今後の課題となってしまった。

The purpose of this study was to determine the acid alignment of the active center of the 44kDa and 50kDa specific proteins produced by the peridentinal pathogenic bacterium Porphyromonas gingivalis. The research method and result are different. After purification, the active site is treated with ALCK. This is the first time that the film has been used in the film industry. Radioactive energy is not available in any way. The membrane is dissociated from the high speed liquid, and the radioactivity is separated from the high speed liquid. This is a high-speed liquid purification process. The results of the analysis were as follows: Asp-Val-Ala-X-Val-Asn-Gly, Asp-Val-Ala-X-Val-Asn-Gly, Asp-Val-Val-Asn-Gly, Asp-Val-Val-Val, Asp-Val X is a specific radioactive substance. It's a radioactive substance. It's a radioactive substance. The nature of the protein and the origin of the protein residues were estimated. This is a proof that the above elements are not matched (3 and 14 items). The results, 3 items of information, the above unknown information, are detected. This is the case with X, Cys, Asn, Gly, Asp-Val-Ala-Cys-Val-Asn-Gly. The active site of Clostridium histolyticum is Asp-Ala-Cys-Leu-Met-Gly. In the case of a special case, remember that the whole process is the same, the membrane is free, the liquid is high, and the radioactivity is very large. This is the first time I've ever seen a woman. The reason for this is that there are problems with acid allocation. No, I don't think so.