Porphyromonas gingivalisプロテアーゼの活性中心構造の解析

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本研究の目的は、歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisの産生する44kDaアルギニン特異的プロテアーゼ(赤血球凝集性)と50kDaリジン特異的プロテアーゼの活性中心のアミノ酸配列を決定することであった。研究方法と結果は次のとおりである。アルギニン特異的プロテアーゼの場合 プロテアーゼを精製後、これを[^3H]アセチルリジンクロロメチルケトン(ALCK)で処理し、活性部位をラベルした。この様にラベルしたプロテアーゼをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、PVDF膜に電気的に転写した。放射能を有するバンドを切り取り、エンドプロテイナーゼAsp-Nで消化した。膜から遊離したペプチドを高速液クロにより分離し、放射能を有するピーク(1本のみ検出された)を単離した。このペプチドを水素化ホウ素ナトリウムで処理した後(クロロメチルケトンのケトン基を還元するため)、高速液クロで精製した。得られたペプチドを、そのままアミノ酸配列分析にかけたところ、Asp-Val-Ala-X-Val-Asn-GLyと決定された。Xは特定のアミノ酸とは同定されなかったが、配列分析機のチャート上には未知の放射性ピークが検出された。このピークは、本プロテアーゼの性質より、ALCKと反応したシステイン残基由来のものと推定される。このことを証明するためにソマトスタチン(3及14番目のアミノ酸がCys)をモデルペプチドとして選び、ALCKと反応させた後、上述の様に還元し配列分析を行った(4サイクル目まで)。その結果、3番目のサイクルに上述の未知のピークが検出された。この様に、XはCysと決定され、全配列はAsp-Val-Ala-Cys-Val-Asn-Glyと決定された。この配列は、Clostridium histolyticum由来のプロテアーゼであるクロストリパインの活性部位配列Asp-Ala-Cys-Leu-Met-Glyによく似ていた。リジン特異的プロテアーゼの場合 上記と全く同様に実験を行おうとし、膜から遊離させたペプチドを高速液クロにより単離しようとしたが、放射能が非常に幅広いピークとして検出された。このピークを単離して配列分析を行ったが、アミノ酸としては同定されなかった。理由は分からないが、アミノ酸配列上の問題かもしれない。不本意ながら今後の課題となってしまった。