癌抗原発現ウイルスと癌抗原特異的T細胞の併用療法の開発

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本研究は、抗原ペプチド発現遺伝子をゲノム内に組み込んだ腫瘍溶解性ウイルスHF10を作製し腫瘍に感染させ、さらにその癌抗原ペプチドに特異的に反応する遺伝子改変リンパ球を静脈輸注する事により、腫瘍溶解性ウイルス療法と免疫細胞療法の癌治療効果を相補的に高める新規癌治療法開発を目的とした。平成28年度は、ovalbumin(OVA)発現遺伝子を組み込んだ遺伝子改変HF10の構築を行った。HF10ゲノム内のOVA遺伝子挿入部位は、欠損のため機能的ではないUL43遺伝子部位とした。OVA遺伝子はCMVプロモーターにより発現を制御し、IRESを介してZsGreen1も発現するようにした。CMV promoter derived OVA遺伝子カセットの両端に各500塩基ずつUL43遺伝子と同じ塩基配列を配したプラスミドを構築した。このプラスミドをリニア化して、Vero細胞にHF10ゲノム及びpGuide-itと共にトランスフェクションし、1%アガロースDMEMを重層した。3～4日間培養後にZsGreen1を目印にプラークをピックアップし、遺伝子改変HF10の単離を行った。以上の操作により、まずZsGreen1遺伝子のみを導入したGreen-HF10の構築に成功した。PAN02細胞とSCCⅦ細胞に親株HF10またはGreen-HF10を10, 1, 0.1, 0.01 MOIで感染させ、継時的にMTT assayにより細胞の生存率を調べた結果、Green-HF10は親株HF10の殺細胞能力を維持していることを確認した。また、pCI-neo-cOVAをPAN02細胞に導入した24時間後、400 ug/ml G418を加えて培養し、増殖した細胞を単離してOVAを安定発現するPAN02/OVA細胞を作製した。フローサイトメトリーにより、OVAが安定発現していることを確認した。