デコンボリューション加工を用いて骨格筋ミトコンドリアの形態を可視化する

今年度はマウス単一筋線維の骨格筋ミトコンドリア染色条件を確立し、骨格筋ミトコンドリアの3次元データを得ることが目的であった。7週齢C57BL6雄マウスの長趾伸筋を摘出し、コラゲナーゼ処理により単一筋線維を採取した。単一筋線維をミトコンドリア標識蛍光試薬MitoTrackerで20分間染色し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。筋線維の透明化のために、70%の2,2′-チオジエタノールで筋線維を1時間インキュベートした。スライドグラス封入時に褪色防止剤を用いて蛍光色素の褪色防止を行った。観察・撮影には共焦点顕微鏡を用い、筋線維をZ軸方向に0.5 μmステップで連続して撮影した。得られた画像データをデコンボリューション処理し、より分解能の高い画像データを取得した。得られた画像を3次元構築し、骨格筋ミトコンドリアの3次元データを作成した。得られた3次元データは一部蛍光色素の褪色があったが、筋線維全体のミトコンドリアについて画像データの取得ができた。本研究より、骨格筋のミトコンドリアはサルコメア構造に沿って局在していることや細胞核の周りに多く集積していることが示された。今後は、ミトコンドリアの量的・形態的変化が起こると考えられるランニングホイールを用いた自発的走トレーニングや坐骨神経切除による筋萎縮を行った際に、ミトコンドリアがどのような適応を示すか、本年度に確立した顕微鏡観察を用いて解析を実施予定である。合わせて生化学的解析も行い画像データとの比較も行う。

今年度はマウス単一筋線維の骨格筋ミトコンドリア染色条件を確立し、骨格筋ミトコンドリアの3次元データを得ることが目的であった。7週齢C57BL6雄マウスの長趾伸筋を摘出し、コラゲナーゼ処理により単一筋線維を採取した。単一筋線維をミトコンドリア標識蛍光試薬MitoTrackerで20分間染色し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。筋線維の透明化のために、70%の2,2′-チオジエタノールで筋線維を1時間インキュベートした。スライドグラス封入時に褪色防止剤を用いて蛍光色素の褪色防止を行った。観察・撮影には共焦点顕微鏡を用い、筋線維をZ軸方向に0.5 μmステップで連続して撮影した。得られた画像データをデコンボリューション処理し、より分解能の高い画像データを取得した。得られた画像を3次元構築し、骨格筋ミトコンドリアの3次元データを作成した。得られた3次元データは一部蛍光色素の褪色があったが、筋線維全体のミトコンドリアについて画像データの取得ができた。本研究より、骨格筋のミトコンドリアはサルコメア構造に沿って局在していることや細胞核の周りに多く集積していることが示された。今後は、ミトコンドリアの量的・形態的変化が起こると考えられるランニングホイールを用いた自発的走トレーニングや坐骨神経切除による筋萎縮を行った際に、ミトコンドリアがどのような適応を示すか、本年度に確立した顕微鏡観察を用いて解析を実施予定である。合わせて生化学的解析も行い画像データとの比較も行う。