ミトコンドリアの呼吸活性に対する酸素輸送担体の発現量の意義

氧转运载体表达水平对线粒体呼吸活动的意义

• 批准号: 22800023
• 负责人: 岩中 伸壮
• 金额: $ 1.96万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22800023/
• 关键词: ミオグロビン; ミトコンドリア; 骨格筋細胞

本研究は、酸素輸送担体:ミオグロビン(Mb)を過剰発現あるいは発現抑制する骨格筋培養細胞系を確立するとともに、骨格筋細胞内のMb発現量を調節した時のMbとミトコンドリアの相互作用、親和性、ならびに筋細胞の呼吸活性について検証することを目的とした。本年度は、1)骨格筋芽細胞の選択と筋管への分化条件の検討、2)Mbを過剰発現させるための発現ベクターの作製に取り組んだ。その結果、次のような成果を得た。1)骨格筋培養細胞としてラット由来骨格筋芽細胞(L6)を用いたが、推奨培養条件では筋管形成が十分ではないため、インスリン刺激による分化誘導を試みた。細胞培養液へのインスリン添加を行ったところ、分化が促進され、筋管細胞が増加したL6細胞を得た。また、分化による発現タンパク質の経時変化を観察したところ、インスリン刺激によりミトコンドリアマーカータンパク質の増加が確認された。2)Mbを過剰発現させるため、哺乳類細胞で高レベルの発現を行うCMVプロモーター搭載のpcDNA3ベクターを用い、Mb cDNAをTAクローニングにより組み込んだ。さらに、過剰発現させた際にタンパク質相互作用、親和性を確認するため、エピトープタグであるc-mycを付加し、myc/Mb/pcDNA3発現ベクターを得た。c-mycは免疫反応性の高いエピトープタグであり、大きさが比較的小さいため、Mbのような低分子タンパク質の機能を阻害しにくいと考えられる。来年度は,作製した発現ベクターを用いて遺伝子導入を行い、Mbを安定して過剰発現するL6骨格筋芽細胞株を作製し、Mbとミトコンドリアとの関連性や呼吸活性の変化の解明に取り掛かる予定である。

This study aimed to establish a cell line in culture of bone marrow cells containing an acid transporter: Mb (Mb)-mediated interaction, affinity, and respiratory activity of bone marrow cells. In this year, the following components were selected: 1) selection of skeletal muscle bud cells and investigation of differentiation conditions of skeletal muscle tubes; 2) selection of Mb cells for development of skeletal muscle cells. The results of the survey are as follows: 1)Cultured cells from bone marrow cells (L6) were stimulated by medium and medium culture conditions to form muscle tubes. Cell culture medium was added to promote cell differentiation and increase the number of L6 cells. In addition, the increase in the quality of the product is confirmed by the change in the quality of the product. 2)Mb cDNA development in mammalian cells, high protein development in mammalian cells, CMV development, and Mb cDNA development. In addition, myc/Mb/pcDNA3 was found in the presence of c-myc, myc/Mb/pcDNA3, myc/Mb/pcDNA3 and myc/Mb/pcDNA3. c-myc is immune to high molecular weight and low molecular weight. In the coming year, the L6 cell line was established and the correlation between Mb and Mb was analyzed.