細胞間隙の分子動態可視化による神経活動抑制の脳内伝播メカニズム解明

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本研究の目的は、蛍光タンパク質センサーを用いたライブイメージングにより、細胞間隙に存在する分子の動態解析を達成することである。本年度は、その技術基盤の確立を目指し、研究計画に従って以下の二項目を遂行した。1) 蛍光タンパク質センサーを細胞膜外葉上に提示させる手法について検討した。pDisplayベクターやその改変ベクターを用い、HEK293細胞に蛍光タンパク質センサー遺伝子を導入し、発現を試みた。蛍光タンパク質単独および一部の蛍光タンパク質センサーでは細胞膜上での発現が確認できた一方で、細胞内での凝集体形成や、蛍光が確認できないセンサーがあることが明らかとなった。2）細胞膜上に提示された蛍光タンパク質センサーの、リガンド結合特異的な輝度変化を検討した。細胞膜上に提示できたセンサーのうち、細胞外へのリガンド投与に応じた輝度変化を示すものを数種類確認した。一方で、細胞外へのリガンド投与に応じた輝度変化を示さないセンサーがあることも明らかとなった。センサーのもつ性質が細胞外環境に適さないことや、付加配列がセンサーの立体構造変化に影響したためと推測している。