CTニューロンの全シナプス入力可視化による皮質-視床ループ回路構造の解明

通过可视化 CT 神经元的所有突触输入来阐明皮质丘脑环路结构

• 批准号: 22K20694
• 负责人: 岡本 慎一郎
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20694/
• 关键词: 神経形態学; 組織学; 固定法; 標識法; AAV; 大脳皮質; 錐体細胞; シナプス入力

2022年度は、Glyoxal固定の条件検討及び、皮質6層錐体細胞に感染しやすいAAVベクターのセロタイプについて検討を行なった。【Glyoxal固定の条件検討】Glyoxal溶液を用いて固定した脳サンプルに対して免疫染色をおこない、将来の解析で使用する可能性のある各種抗体について、染色性を評価した。その結果、Glyoxal固定サンプルでは、細胞膜上に局在する分子の染色性が大きく向上することを見出した。一方、細胞質に存在するタンパクの検出能は、一般的なPFA固定よりも劣っていることも明らかとなった。染色する標的にあわせて両固定法を使い分けることにより、従来よりも効率的に標的分子を標識することが可能となった。【AAVベクターのセロタイプ検討】レポーター蛋白を標的細胞に導入する手段として使われるAAVベクターだが、セロタイプによって感染する細胞に偏りが生じることが知られている。そこで、AAV2/1, 2, 5, 6, 8, 9, retroの各種ベクターを皮質に注入し、感染性について評価したところ、全てのセロタイプで感染に層特異性が認められた。【ルシファーイエロー注入による標識法の開発】本研究の目的は皮質６層の錐体細胞の解析であるが、さらにその先の研究では全層の錐体細胞や各種抑制性細胞なども対象とした解析を目指しており、その為には全ての細胞種に対して使用可能な普遍的標識法の確立が必要となる。しかしながら、ウイルスベクターを用いた標識法では、感染特異性という壁を突破することが難しいことが判明した。そこで、細胞種非特異的な標識法として、固定脳の神経細胞へルシファーイエローを電気注入する手法に着目し、同標識法の確立を目指すこととした。

In the year of 2022, Glyoxal fixed the condition and infected the somatic cells of the skin. The cells were infected with AAV cells. [Glyoxal immobilization conditioned] Glyoxal solution was used to fix the immunostaining method for immunostaining, and to analyze the possibility of the use of various antibodies and staining in the future. Results: the results of Glyoxal fixation and cell membrane staining showed that there was a significant increase in molecular staining. On the other hand, there are some problems in the cell system, such as the production of energy, the general PFA fixation, the poor performance, the poor performance and the poor performance. The dyeing method makes it possible to identify the molecular markers of the rate of the dye. [AAV