タンパク質飢餓への適応を可能とするチロシンセンシングの分子機構の解明

本年度は、非必須アミノ酸チロシンの感知実体を明らかにするために、ショウジョウバエを用いた核内受容体に着目した解析と、哺乳類細胞を用いた網羅的なsiRNAスクリーニングを実施した。まず着目した核内受容体についてリガンド結合部位への点変異を導入し、チロシン有無で変化する表現型についての寄与を検討した。チロシン欠乏に応答して活性化することを見出しているATF4レポーターの蛍光を観察したところ、リガンド結合部位への点変異によりその応答が鈍ることを見出した。同様の結果は当該核内受容体の機能欠損個体でも観察されたことから、チロシンセンシングへの関与が示唆された。しかし、幼虫の摂食量変化などこれまで着目してきた個体全体としての表現型に大きな変化は見られなかった。そこで成虫に視点を移し、チロシン制限で見られる寿命延長や食嗜好性の変化に対する当該核内受容体の寄与を検討中である。また、この核内受容体の精製タンパク質とチロシンを用いた生化学的なリガンド結合アッセイでは、チロシンとの結合を明確に証明することができなかった。精製タンパク質のDNA結合ドメインの疎水性が高く溶解していなかったことが原因の一つと考えられるため、リガンド結合部位のみを用いた結合アッセイに取り組んでいる。哺乳類細胞を用いたsiRNAスクリーニングについても終了させ、チロシンセンシングをはじめアミノ酸飢餓やERストレスに共通して関与する可能性のある経路としてスプライシングイベントが浮上した。スプライシングによる転写因子活性制御機構はほとんどわかっていないため、次年度はRNAseqを行うなどして細胞にどのような転写変化が起こっているのか明らかにしていく。

本年度は、非必須アミノ酸チロシンの感知実体を明らかにするために、ショウジョウバエを用いた核内受容体に着目した解析と、哺乳類細胞を用いた網羅的なsiRNAスクリーニングを実施した。まず着目した核内受容体についてリガンド結合部位への点変異を導入し、チロシン有無で変化する表現型についての寄与を検討した。チロシン欠乏に応答して活性化することを見出しているATF4レポーターの蛍光を観察したところ、リガンド結合部位への点変異によりその応答が鈍ることを見出した。同様の結果は当該核内受容体の機能欠損個体でも観察されたことから、チロシンセンシングへの関与が示唆された。しかし、幼虫の摂食量変化などこれまで着目してきた個体全体としての表現型に大きな変化は見られなかった。そこで成虫に視点を移し、チロシン制限で見られる寿命延長や食嗜好性の変化に対する当該核内受容体の寄与を検討中である。また、この核内受容体の精製タンパク質とチロシンを用いた生化学的なリガンド結合アッセイでは、チロシンとの結合を明確に証明することができなかった。精製タンパク質のDNA結合ドメインの疎水性が高く溶解していなかったことが原因の一つと考えられるため、リガンド結合部位のみを用いた結合アッセイに取り組んでいる。哺乳類細胞を用いたsiRNAスクリーニングについても終了させ、チロシンセンシングをはじめアミノ酸飢餓やERストレスに共通して関与する可能性のある経路としてスプライシングイベントが浮上した。スプライシングによる転写因子活性制御機構はほとんどわかっていないため、次年度はRNAseqを行うなどして細胞にどのような転写変化が起こっているのか明らかにしていく。