メチル化酵素をターゲットとした肝細胞癌増殖メカニズムの解明

阐明靶向甲基转移酶的肝细胞癌生长机制

• 批准号: 22K20949
• 负责人: 堀 雄哉
• 金额: $ 1.75万
• 依托单位: Wakayama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20949/
• 关键词: 肝細胞癌; メチル化; SMYD2

当科で保存していた肝細胞癌手術症例の凍結切片からRNAを抽出し、cDNAに逆転写しcDNA libraryを作成した。RNA抽出にはRNA protect Cell Reagent（QIAGEN）を用いて細胞を回収、RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN）を用いて製品プロトコールに従ってRNAを単離した。続いてSuperScript III RT (invitorgen)を用いてreverse transcriptionを行った。2．Quantitative real-time PCR1にて作成したcDNAを用いて、quantitative real-time PCRを施行した。すでにSMYD2に特異的なquantitative real-time PCR用のprimerを設計しており、invitrogen社に依頼してオリゴを作成・購入した。Roche Applied ScienceのLightCyclerを用い、サンプルとなるcDNA・primer・2xMaster Mixを混注してPCR反応を行った。3．免疫組織学的検討(Immunohistochemistry)1次抗体はSanta Cruz Biotechnology社のAnti-SMYD2 (gout polyclonal antibody, C-20, sc-79084) を用いた。染色キットはDAKO EnVisonシステムを使用し、2日法で免疫染色を行った。1日目は脱パラフィン・脱キシレン・親水処理・抗原賦活化・quenching・ブロックを行い1次抗体にて4℃で一晩反応させた。2日目は洗浄後2次抗体としてDAKO® Envision System-HRPを滴下して反応させ、染色した。Hematoxylinでcounter染色を行い、脱水・固定・乾燥後観察した。

In the department, the frozen sections of hepatocellular carcinoma surgical cases were preserved, the RNA was extracted, and the cDNA was written in reverse and the cDNA library was created. RNA extraction and RNA protect Cell Reagent (QIAGEN) are used for cell recovery, and RNeasy Plus Mini kit (QIAGEN) is used for RNA extraction and extraction.続いてSuperScript III RT (invitorgen)を用いてreverse transcriptionを行った. 2. Quantitative real-time PCR1 was created and cDNA was used, and quantitative real-time PCR was performed. The SMYD2-specific quantitative real-time PCR was designed by Primer and manufactured and purchased by Invitrogen Corporation. Roche Applied Science's LightCycler is used, and the サンプルとなるcDNA・primer・2xMaster Mix is ​​used for PCR reaction. 3． The primary antibody for immunohistochemistry is Anti-SMYD2 (gout polyclonal antibody, C-20, sc-79084) from Santa Cruz Biotechnology Co., Ltd. The staining method DAKO EnVison Stainless Steel is used, and the 2-day immunostaining method is used. 1 day use of primary antibody, 4°C and 1 day anti-antibody, hydrophilic treatment, antigen activation, quenching, etc. On the 2nd day, after washing the eyes, the antibody was added twice and DAKO® Envision System-HRP was dropped, reacted and stained. Hematoxylin is used for counter staining, dehydration, fixation, and drying for inspection.