メチル化酵素をターゲットとした肝細胞癌増殖メカニズムの解明

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当科で保存していた肝細胞癌手術症例の凍結切片からRNAを抽出し、cDNAに逆転写しcDNA libraryを作成した。RNA抽出にはRNA protect Cell Reagent（QIAGEN）を用いて細胞を回収、RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN）を用いて製品プロトコールに従ってRNAを単離した。続いてSuperScript III RT (invitorgen)を用いてreverse transcriptionを行った。2．Quantitative real-time PCR1にて作成したcDNAを用いて、quantitative real-time PCRを施行した。すでにSMYD2に特異的なquantitative real-time PCR用のprimerを設計しており、invitrogen社に依頼してオリゴを作成・購入した。Roche Applied ScienceのLightCyclerを用い、サンプルとなるcDNA・primer・2xMaster Mixを混注してPCR反応を行った。3．免疫組織学的検討(Immunohistochemistry)1次抗体はSanta Cruz Biotechnology社のAnti-SMYD2 (gout polyclonal antibody, C-20, sc-79084) を用いた。染色キットはDAKO EnVisonシステムを使用し、2日法で免疫染色を行った。1日目は脱パラフィン・脱キシレン・親水処理・抗原賦活化・quenching・ブロックを行い1次抗体にて4℃で一晩反応させた。2日目は洗浄後2次抗体としてDAKO® Envision System-HRPを滴下して反応させ、染色した。Hematoxylinでcounter染色を行い、脱水・固定・乾燥後観察した。