Expansion of metabolic map and comprehensive annotation of genes with unknown enzyme function by next-generation metabolomic technologies

本年度は、「①エピメタボライトライブラリーの構築と代謝マップの拡張」および「②3960種の大腸菌単一遺伝子破壊株の網羅的定量メタボローム分析」の課題に取り組んだ。課題①では、大腸菌、酵母、ヒトに含まれることが知られている2,244種類の代謝物に対して56種類の代謝反応様式に基づくin silico代謝反応を最大で2段階行うことで約60万種のエピメタボライト候補を算出した。続いて、得られたエピメタボライト候補に対してin silico MS/MS predictionを行い、これらの情報をin silico epimetabolite database（IEMDB）に格納した。12C6-または13C6-グルコースを用いて培養した大腸菌サンプルを用いて検証した結果、2,046種類の親水性代謝物候補の中から標準品を指標に106種の代謝物を同定し、IEMDBによるプリカーサーイオンの一致度およびプロダクトイオンのアノテーションスコアを基に90種類のエピメタボライトの帰属に成功した。課題②では、「96-wellプレートを使用した細胞培養および高速・高精度のサンプル調製法の開発」を行った。Synergy HTXマルチモード・プレートリーダー (BioTek) を用いて96-wellプレートに播種した野生型の大腸菌の増殖速度を基に、培養条件の最適化を行った。具体的には、前培養や本培養での菌体播種量、回収時間、菌体回収法、抽出操作プロトコルを確立し、培地の添加やサンプルの回収操作などを自動分注器 (ASSIST PLUS, INTEGRA) を使用して行うことで、96-wellプレートを使用した迅速かつ再現性の高い、大腸菌の培養・サンプル調製法の立案に成功した。

本年度は、「①エピメタボライトライブラリーの構築と代謝マップの拡張」および「②3960種の大腸菌単一遺伝子破壊株の網羅的定量メタボローム分析」の課題に取り組んだ。課題①では、大腸菌、酵母、ヒトに含まれることが知られている2,244種類の代謝物に対して56種類の代謝反応様式に基づくin silico代謝反応を最大で2段階行うことで約60万種のエピメタボライト候補を算出した。続いて、得られたエピメタボライト候補に対してin silico MS/MS predictionを行い、これらの情報をin silico epimetabolite database（IEMDB）に格納した。12C6-または13C6-グルコースを用いて培養した大腸菌サンプルを用いて検証した結果、2,046種類の親水性代謝物候補の中から標準品を指標に106種の代謝物を同定し、IEMDBによるプリカーサーイオンの一致度およびプロダクトイオンのアノテーションスコアを基に90種類のエピメタボライトの帰属に成功した。課題②では、「96-wellプレートを使用した細胞培養および高速・高精度のサンプル調製法の開発」を行った。Synergy HTXマルチモード・プレートリーダー (BioTek) を用いて96-wellプレートに播種した野生型の大腸菌の増殖速度を基に、培養条件の最適化を行った。具体的には、前培養や本培養での菌体播種量、回収時間、菌体回収法、抽出操作プロトコルを確立し、培地の添加やサンプルの回収操作などを自動分注器 (ASSIST PLUS, INTEGRA) を使用して行うことで、96-wellプレートを使用した迅速かつ再現性の高い、大腸菌の培養・サンプル調製法の立案に成功した。