Development of MALDI glycotyping technology targeting a wide range of biological samples.

初年度は糖タンパク質を対象とした直接解析条件の改良をまず実施した。その結果、1,5-diaminonaphtalen (DAN)を2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)に添加し、少量のアルカリ金属を添加したマトリックスがf mol量の無処理糖タンパク質に対し、高感度N-結合型糖鎖選択的切断と糖鎖選択的イオン化を実現できることを見出した。また、このマトリックスはウズラおよび鶏の卵白から直接N-結合型糖鎖のパターン解析が可能となることを実証した。さらに、この反応系をバクテリアの糖鎖の直接解析へと応用することを検討したところ、カラムやHILIC操作なしで、１コロニーの大腸菌から１時間以内にそのO抗原糖鎖パターンを解析できることを見出した。さらに、糖鎖亜型が報告されているO1型大腸菌とO6型大腸菌を購入し、そのO抗原糖鎖パターンを調査したところ、調査したO1型大腸菌はO1Aと呼ばれる糖鎖亜型であり、O6はJannsonらにより報告された糖鎖亜型であることを明確に示すスペクトルが確認された。これまで糖鎖亜型の確認には大腸菌の大量培養、LSPのフェノール抽出、O抗原の弱酸加水分解、および数段階のカラム操作を経てmg単位のO抗原多糖を分離し、これをNMRにより解析する必要があった。これに対し、我々が見出した技術ではいずれも寒天培地に蒔いた菌株から1コロニーをPCRチューブに入れ、簡単なチューブ内処理によりそれぞれのO抗原を同定できることを実証した。また、O1、O6、O157抗原を有する3種の大腸菌を混合して寒天培地に蒔き任意の10コロニーを選択し、解析したところ、それぞれのコロニーのO抗原を並列操作で同定できることを実証した。さらに、1コロニーを分割しそれぞれからタンパク質解析による菌種同定と糖鎖解析によるO抗原同定を並行して実施できることを実証した。

初年度は糖タンパク質を対象とした直接解析条件の改良をまず実施した。その結果、1,5-diaminonaphtalen (DAN)を2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)に添加し、少量のアルカリ金属を添加したマトリックスがf mol量の無処理糖タンパク質に対し、高感度N-結合型糖鎖選択的切断と糖鎖選択的イオン化を実現できることを見出した。また、このマトリックスはウズラおよび鶏の卵白から直接N-結合型糖鎖のパターン解析が可能となることを実証した。さらに、この反応系をバクテリアの糖鎖の直接解析へと応用することを検討したところ、カラムやHILIC操作なしで、１コロニーの大腸菌から１時間以内にそのO抗原糖鎖パターンを解析できることを見出した。さらに、糖鎖亜型が報告されているO1型大腸菌とO6型大腸菌を購入し、そのO抗原糖鎖パターンを調査したところ、調査したO1型大腸菌はO1Aと呼ばれる糖鎖亜型であり、O6はJannsonらにより報告された糖鎖亜型であることを明確に示すスペクトルが確認された。これまで糖鎖亜型の確認には大腸菌の大量培養、LSPのフェノール抽出、O抗原の弱酸加水分解、および数段階のカラム操作を経てmg単位のO抗原多糖を分離し、これをNMRにより解析する必要があった。これに対し、我々が見出した技術ではいずれも寒天培地に蒔いた菌株から1コロニーをPCRチューブに入れ、簡単なチューブ内処理によりそれぞれのO抗原を同定できることを実証した。また、O1、O6、O157抗原を有する3種の大腸菌を混合して寒天培地に蒔き任意の10コロニーを選択し、解析したところ、それぞれのコロニーのO抗原を並列操作で同定できることを実証した。さらに、1コロニーを分割しそれぞれからタンパク質解析による菌種同定と糖鎖解析によるO抗原同定を並行して実施できることを実証した。