Identification of gene networks associated with secondary cell wall layer structure.

二次壁はセルロースミクロフィブリルの配向角度の違いにより３層に区別される。セルロースミクロフィブリルの配向は表層微小管により制御されており、表層微小管とセルロースミクロフィブリルの配向には同調的な変化が見られる。しかし、二次壁の層構造が構築される過程で表層微小管の配向がどのような分子基盤により制御されているかについて多くの謎が残されている。研究代表者らはポプラを用いた遺伝子スクリーニングの結果、S2層の形成を担う転写因子（TF26およびTF26b）を同定している。そこで、本研究ではTF26/26bを起点としたS2層の形成機構の解明とTF26/26bの進化的機能保存性の解明を試みる。まず、トランスクリプトーム解析によりTF26/TF26bの下流で機能する微小管関連タンパク質の同定を行った。TF26およびTF26bにグルココルチコイド受容体（GR）を連結した融合遺伝子を導入したポプラ過剰発現体（35S:TF26-GR、35S:TF26b-GR）を誘導剤（デキサメタゾン）で処理し、一定時間おきにサンプリングを行った。その後、total RNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて発現遺伝子の情報を取得した。次に、二次壁形成への関与が推定される微小管関連タンパク質（10遺伝子）について、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子欠損ポプラの作製に着手した。CRISPR/Cas9用の遺伝子コンストラクトを作製後、ポプラへ形質転換を行い、再生個体が得られた遺伝子についてはゲノム編集パターンの解析を行った。また、TF26/26bの進化的機能保存性を解明するために、スギのTF26/26bオルソログ（２遺伝子）について、CRISPR/Cas9用の遺伝子コンストラクトを作製した後、スギ培養細胞へ形質転換を行い、遺伝子欠損スギの作製に着手した。

二次壁はセルロースミクロフィブリルの配向角度の違いにより３層に区別される。セルロースミクロフィブリルの配向は表層微小管により制御されており、表層微小管とセルロースミクロフィブリルの配向には同調的な変化が見られる。しかし、二次壁の層構造が構築される過程で表層微小管の配向がどのような分子基盤により制御されているかについて多くの謎が残されている。研究代表者らはポプラを用いた遺伝子スクリーニングの結果、S2層の形成を担う転写因子（TF26およびTF26b）を同定している。そこで、本研究ではTF26/26bを起点としたS2層の形成機構の解明とTF26/26bの進化的機能保存性の解明を試みる。まず、トランスクリプトーム解析によりTF26/TF26bの下流で機能する微小管関連タンパク質の同定を行った。TF26およびTF26bにグルココルチコイド受容体（GR）を連結した融合遺伝子を導入したポプラ過剰発現体（35S:TF26-GR、35S:TF26b-GR）を誘導剤（デキサメタゾン）で処理し、一定時間おきにサンプリングを行った。その後、total RNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて発現遺伝子の情報を取得した。次に、二次壁形成への関与が推定される微小管関連タンパク質（10遺伝子）について、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子欠損ポプラの作製に着手した。CRISPR/Cas9用の遺伝子コンストラクトを作製後、ポプラへ形質転換を行い、再生個体が得られた遺伝子についてはゲノム編集パターンの解析を行った。また、TF26/26bの進化的機能保存性を解明するために、スギのTF26/26bオルソログ（２遺伝子）について、CRISPR/Cas9用の遺伝子コンストラクトを作製した後、スギ培養細胞へ形質転換を行い、遺伝子欠損スギの作製に着手した。