Significance of glycoconjugate remodeling by fish sialidase localizing at nucleus

当該年度では、核局在型シアリダーゼNeu4の核局在メカニズムの解明を中心に行った。カラシン目魚類であるメキシカンテトラからNeu4遺伝子をクローニングし、培養細胞において発現させた。その主な局在は核に認められたが、核移行シグナル（NLS)を欠損したNeu4変異体においてはその核局在が完全に消失した。また、インポーチンβ阻害剤処理でもNeu4の核局在が有意に低下したことから、Neu4/インポーチンの相互作用が核局在を制御していることが確認された。しかしその一方で、他の魚類Neu4にもNLSを有するものが存在する。これらNeu4は核に局在を示さないことから、核局在にはNLS以外の因子の関与が予想される。そこでAlphafold2による立体構造予想を行い、魚種間でNeu4を比較したところ、NLS以外に1か所、構造類似性が低い箇所（Less conserved region, LCR)があることがわかった。この変異体を欠損させたメキシカンテトラNeu4は核局在の割合が低下し、同じく核局在を示すスズキ目Neu4においてもLCR欠損により同様の傾向が得られた。しかしこのLCRそのものは核局在を示さない魚類Neu4にも存在する。そこでLCRのアミノ酸配列を比較したところ、カラシン目やスズキ目Neu4のLCRにはSer/Thrが豊富な領域がある事が見いだされ、他の魚類Neu4では認められなかった。そこでこのSer/Thrを他のアミノ酸に置換したところ、Neu4の核局在が有意に低下した。さらにこのSer/Thrを欠損した変異体も同様の細胞内局在を示した。これらの結果から、スズキ目およびカラシン目のNeu4のみが核局在を示す理由として、LCRに含まれる連続的なSer/Thrが重要であることが明らかとなった。

当該年度では、核局在型シアリダーゼNeu4の核局在メカニズムの解明を中心に行った。カラシン目魚類であるメキシカンテトラからNeu4遺伝子をクローニングし、培養細胞において発現させた。その主な局在は核に認められたが、核移行シグナル（NLS)を欠損したNeu4変異体においてはその核局在が完全に消失した。また、インポーチンβ阻害剤処理でもNeu4の核局在が有意に低下したことから、Neu4/インポーチンの相互作用が核局在を制御していることが確認された。しかしその一方で、他の魚類Neu4にもNLSを有するものが存在する。これらNeu4は核に局在を示さないことから、核局在にはNLS以外の因子の関与が予想される。そこでAlphafold2による立体構造予想を行い、魚種間でNeu4を比較したところ、NLS以外に1か所、構造類似性が低い箇所（Less conserved region, LCR)があることがわかった。この変異体を欠損させたメキシカンテトラNeu4は核局在の割合が低下し、同じく核局在を示すスズキ目Neu4においてもLCR欠損により同様の傾向が得られた。しかしこのLCRそのものは核局在を示さない魚類Neu4にも存在する。そこでLCRのアミノ酸配列を比較したところ、カラシン目やスズキ目Neu4のLCRにはSer/Thrが豊富な領域がある事が見いだされ、他の魚類Neu4では認められなかった。そこでこのSer/Thrを他のアミノ酸に置換したところ、Neu4の核局在が有意に低下した。さらにこのSer/Thrを欠損した変異体も同様の細胞内局在を示した。これらの結果から、スズキ目およびカラシン目のNeu4のみが核局在を示す理由として、LCRに含まれる連続的なSer/Thrが重要であることが明らかとなった。