Collective mechanics and regulation of mitotic kinesins for spindle assembly

紡錘体は微小管を基礎に分裂期の細胞内に一過形成される染色体分配装置であり、その構造破綻は染色体分配エラーを通してがんや不妊症と密接に関係する。本研究ではこの紡錘体形成の分子機構を明らかにするため、特に有糸分裂期に活性化される数種のキネシンとその制御因子TPXの相互作用に着眼し、インビトロ再構成の手法を使って機能解析を行った。当該年度は、当初計画に従って、HEK293細胞を利用したTPX2の発現精製系を確立した。TPX2は仮説の検証に必要な数種類を準備した。また共同研究者と共に別の制御因子の発現精製も進めた。準備したコンストラクトを使用して、TPX2の微小管上での結合動態、運動能、隣接微小管の架橋特性等の解析を蛍光一分子イメージング顕微鏡を使って実現した。微小管架橋特性の解析については、その極性を高信頼で決定可能な手法を確立した。さらにTPX2存在化で４量体キネシンの一種であるEg5の微小管上でのATP依存的運動と微小管の架橋特性を詳細に可視化解析できる実験システムを構築し、未同定の機能を発見した。またこれとは独立に高速原子間力顕微鏡や電子顕微鏡を使った超分子構造の解析も進め、キネシン制御因子が示す非構造性ダイナミクスや微小管上での複合体形成能について新たな洞察を得た。これと並行して、次年度以降の目標である他種の４量体キネシンの解析準備を研究分担者と協力して進め、発現精製系の立ち上げと精製サンプルの活性評価を行った。

紡錘体は微小管を基礎に分裂期の細胞内に一過形成される染色体分配装置であり、その構造破綻は染色体分配エラーを通してがんや不妊症と密接に関係する。本研究ではこの紡錘体形成の分子機構を明らかにするため、特に有糸分裂期に活性化される数種のキネシンとその制御因子TPXの相互作用に着眼し、インビトロ再構成の手法を使って機能解析を行った。当該年度は、当初計画に従って、HEK293細胞を利用したTPX2の発現精製系を確立した。TPX2は仮説の検証に必要な数種類を準備した。また共同研究者と共に別の制御因子の発現精製も進めた。準備したコンストラクトを使用して、TPX2の微小管上での結合動態、運動能、隣接微小管の架橋特性等の解析を蛍光一分子イメージング顕微鏡を使って実現した。微小管架橋特性の解析については、その極性を高信頼で決定可能な手法を確立した。さらにTPX2存在化で４量体キネシンの一種であるEg5の微小管上でのATP依存的運動と微小管の架橋特性を詳細に可視化解析できる実験システムを構築し、未同定の機能を発見した。またこれとは独立に高速原子間力顕微鏡や電子顕微鏡を使った超分子構造の解析も進め、キネシン制御因子が示す非構造性ダイナミクスや微小管上での複合体形成能について新たな洞察を得た。これと並行して、次年度以降の目標である他種の４量体キネシンの解析準備を研究分担者と協力して進め、発現精製系の立ち上げと精製サンプルの活性評価を行った。