Functional elucidation of evolutionarily acquired enhancer sequences that generate diversity in hindlimb position

我々はこれまでの研究で、「四肢動物の後肢の位置の多様性は、胎児期の中軸中胚葉に発現する分泌因子であるGdf11の発現開始タイミングの違いによって生み出される」と言う発生学的メカニズムを明らかにした。そこで本研究では、後肢の位置の多様性を生み出すGdf11の発現開始タイミングが、何故種によって異なるのか、その分子機構を明らかにすることを目的としている。そのために、頭から後肢までの脊椎骨の数が異なるスッポン胚、ニワトリ胚、マウス胚、シマヘビ胚を実験材料として用い、①これまでの実験ですでに進めてきた進化的に保存された2つのGdf11のエンハンサーによる四肢動物としての後肢の位置のおおまかな決定機構と、②種に固有な複数のエンハンサーによる後肢の位置の多様性を生み出した分子機構、を解析することで、四肢動物における後肢の位置の多様性を生み出した進化の分子実体を機能的な証明を持って明らかにすることを目指している。初年度の研究では、これまで明らかにしてきたGdf11のエンハンサー候補領域をCRISPER/Cas9システムを用いて標的遺伝子破壊したマウスにおけるGdf11の発現量をRT-qPCRを用いて解析した。その結果、領域Bと領域Fを破壊するとGdf11の発現量が減少したことから両方ともそれぞれGdf11のエンハンサーであることが明らかとなった。次に、シマヘビにおけるGdf11のエンハンサー候補配列を見つけるために、これまでに解読したシマヘビの全ゲノムにシマヘビの前体節中胚葉の細胞のATAC-seqの結果をマッピングし、オープンクロマチンの領域を明らかにした。Gdf11遺伝子座周辺の１０個の領域をPCRで単離し、tk-EGFPベクターの上流に挿入した。ニワトリ胚を用いて前体節中胚葉におけるエンハンサー活性を調べた結果、弱いエンハンサー活性を示す領域のみであることが判明した。

我々はこれまでの研究で、「四肢動物の後肢の位置の多様性は、胎児期の中軸中胚葉に発現する分泌因子であるGdf11の発現開始タイミングの違いによって生み出される」と言う発生学的メカニズムを明らかにした。そこで本研究では、後肢の位置の多様性を生み出すGdf11の発現開始タイミングが、何故種によって異なるのか、その分子機構を明らかにすることを目的としている。そのために、頭から後肢までの脊椎骨の数が異なるスッポン胚、ニワトリ胚、マウス胚、シマヘビ胚を実験材料として用い、①これまでの実験ですでに進めてきた進化的に保存された2つのGdf11のエンハンサーによる四肢動物としての後肢の位置のおおまかな決定機構と、②種に固有な複数のエンハンサーによる後肢の位置の多様性を生み出した分子機構、を解析することで、四肢動物における後肢の位置の多様性を生み出した進化の分子実体を機能的な証明を持って明らかにすることを目指している。初年度の研究では、これまで明らかにしてきたGdf11のエンハンサー候補領域をCRISPER/Cas9システムを用いて標的遺伝子破壊したマウスにおけるGdf11の発現量をRT-qPCRを用いて解析した。その結果、領域Bと領域Fを破壊するとGdf11の発現量が減少したことから両方ともそれぞれGdf11のエンハンサーであることが明らかとなった。次に、シマヘビにおけるGdf11のエンハンサー候補配列を見つけるために、これまでに解読したシマヘビの全ゲノムにシマヘビの前体節中胚葉の細胞のATAC-seqの結果をマッピングし、オープンクロマチンの領域を明らかにした。Gdf11遺伝子座周辺の１０個の領域をPCRで単離し、tk-EGFPベクターの上流に挿入した。ニワトリ胚を用いて前体節中胚葉におけるエンハンサー活性を調べた結果、弱いエンハンサー活性を示す領域のみであることが判明した。