細胞の極性を担う非中心体性微小管ネットワーク形成機構

负责细胞极性的非中心体微管网络形成机制

基本信息

批准号：
22H02795
负责人：
仁田亮
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02795/
关键词：
CAMSAP 非中心体性微小管極性クライオ電子顕微鏡 CAMSAP2

项目摘要

消化管上皮細胞、神経細胞、心筋細胞など、高度な極性を持つ細胞の形態形成に重要な非中心体性微小管ネットワークがどのように形成されるかを解明するため、非中心体性微小管のマイナス端に結合することが報告されているCAMSAP2の機能・構造解析を、共焦点顕微鏡、全反射蛍光顕微鏡、クライオ電子顕微鏡などを用いて行った。CAMSAP2は単独で相分離を起こし、その内部にチューブリン (微小管を作るタンパク質) を取り込んで濃縮し、短時間で数え切れないほどの微小管重合核を形成すること、さらにそこが微小管形成中心となり、放射状に微小管が伸長し、Cam2-asterを形成することを確認した。これらの成果は、ELife誌に掲載された。また、微小管ネットワーク形成過程を高速動画として捉えるため原子間力顕微鏡による解析を、また原子分解能構造として捉えるためにクライオ電子顕微鏡単粒子解析法を用いた解析を行なっており、いずれも順調にデータを取得し解析、論文執筆へ向けた準備中である。さらに、CAMSAPによる微小管ネットワーク形成過程を可視化すべく、クライオ電子線トモグラフィー法の整備をHeLa細胞などを用いて進めている。急速凍結条件の検討、Cryo-CLEM法によるタンパク質局在の検出、Cryo-FEB-SEM法による凍結試料の菲薄化、断層像からの目的構造のDeep learningによる自動抽出など、様々な段階の整備を行なっている。

To clarify how non-centrosomal microtubule networks, which are important for the morphogenesis of highly polar cells such as gastrointestinal epithelial cells, neurons, and cardiomyocytes, are formed, functional and structural analysis of CAMSAP2, which has been reported to bind to the negative ends of non-centrosomal microtubules, was performed using confocal microscopy, total reflection fluorescence显微镜，冷冻电子显微镜等。 CAMSAP2单独进行相分离，并在其内部浓缩微管蛋白（一种制造微管的蛋白质），在短时间内形成无数的微管聚合核，并确认它成为微管的中心，并将其微管延伸，形成cam2-Apter。这些结果发表在Elife杂志上。此外，为了捕获微管网络形成过程作为高速视频，使用原子力显微镜进行了分析，并为了捕获原子分辨率结构，正在执行低温电子显微镜单粒子分析方法。所有这些都是稳步获取数据，分析它们并为它们准备编写论文。此外，为了可视化使用CAMSAP形成微管网络的过程，使用HELA细胞和其他方法开发了冷冻电子束断层扫描。我们正在研究各个阶段，包括检查快速冻结条件，使用冷冻-CLEM方法检测蛋白质定位，使用Cryo-FEB-SEM方法将冷冻样品变薄，以及通过深度学习从层析成绩自动从层析成像图像中自动提取目标结构。